Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

тклоняется от теоретического [121].

В настоящее время применяются ионообменники на основе декстрана и полиакриламидные гели, содержащие ионогенные группы (карбоксиметильные, диэтиламиноэтильные и др.); плотность ионизируемых групп в случае декстрановых ионообмен-ников (2—5 мокв/г) может быть выше, чем у целлюлозных ионообменников. Следовательно, они имеют высокое сродство к полиэлектролитам и в то же время сохраняют в значительной степени свойства молекулярных сит.

Ионообменные гели часто успешно использовали для фракционирования ферментов. Однако при работе с ионообменными гелями могут возникнуть осложнения на стадии элюирования из-за изменений рН в результате обмена ионов буфера с ионами, удерживаемыми ионогенными группами геля; кроме того, при изменении рН и ионной силы может изменяться объем колонки. Отмеченные явления затрудняют теоретический анализ процесса разделения. Складывается впечатление, что ионообменники на основе сефадексов редко обладают преимуществами по сравнению с более традиционными ионообменниками на целлюлозной основе. Тем не менее в некоторых случаях возможность сочетания в одной стадии двух принципов разделения приобретает существенное значение при выделении фермента.

Во многих из описанных методов хроматографии на колонках используется градиентная элюция; устройства для создания градиента описаны в статьях [473, 2374, 3656].

Ж. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Различия в скорости перемещения различных белков (как электролитов) в электрическом поле послужили основой для разработки электрофоретических методов очистки ферментов. Большинство из них применимы в аналитических исследованиях при работе с относительно небольшими количествами веществ, тогда как при применении этих методов для разделения относительно больших количеств белков часто возникают трудности. Определенные трудности связаны также с выделением разделенных веществ. Однако метод электрофореза обладает большой разрешающей способностью и поэтому широко используется в работах по выделению ферментов.

а) Электрофорез со свободной границей в стандартном аппарате Тизелиуса пригоден в основном как тест для определения гомогенности или некоторых свойств очищенного фермента, а не как метод препаративного выделения его в сколько-нибудь

S* Глава 3

значительном количестве. Этот метод не позволяет полностью отделить один белок от другого. Однако с его помощью для специальных исследований можно получить небольшие порции относительно чистого фермента, если он является либо самым подвижным, либо самым медленным из компонентов смеси. При работе с двухсекционной кюветой опыт продолжают до тех пор, пока пики, соответствующие различным компонентам, не разделятся достаточно хорошо. Затем ток выключают и очень осторожно перемещают раствор в обратном направлении до тех пор, пока в верхней половине кюветы (на восходящей границе) не останется только самый быстрый компонент. В верхней части другой секции кюветы часто при этом может оказаться только самый медленный компонент. Таким образом, при отборе жидкости из верхних половин обеих секций кюветы можно получить эти два компонента отдельно в относительно чистом состоянии.

Хьертен недавно опубликовал обзор, в котором собран материал, касающийся теории, оборудования и применения электрофореза с подвижной границей [1973].

б) Зональный электрофорез на инертной поддерживающей среде, такой, как бумага, крахмал или целлюлозный порошок, имеет ряд преимуществ по сравнению с электрофорезом со свободной подвижной границей; такими преимуществами являются компактность приборов, отсутствие конвекционных эффектов и полнота разделения компонентов. При электрофоретическом разделении на простой фильтровальной бумаге можно использовать лишь небольшое количество материала. Этот метод, а также метод электрофореза на полосках ацетата целлюлозы используют главным образом для быстрого аналитического разделения ферментов, которые затем идентифицируют с помощью соответствующих цветных реакций. Прибор Грассмана и Хан-нига [1634] позволяет проводить электрофорез на бумаге непрерывно: раствор буфера равномерно стекает вниз по листу фильтровальной бумаги; электрический ток пропускают в горизонтальном направлении; раствор фермента непрерывно подается на бумагу в точке, расположенной в верхней части листа. Компоненты, имеющие различные подвижности в горизонтальном электрическом поле, стекая к нижнему краю листа, достигают его в различных точках. Таким путем можно разделить значительно большие количества вещества, чем в аппарате Ти-зелиуса, однако поддерживающая среда остается двумерной.

В качестве трехмерной поддерживающей среды для зонального электрофореза используют блоки из порошков крахмала или целлюлозы: на них можно разделить значительное количество материала. Для препаративного электрофореза в блоке из крахмальной пасты [2650] обычно используют горизонтально расположенные камеры, а для электрофореза в целлюлозном по-

Выделение ферментов рошке [3722] — вертикально расположенные колонки. Перед извлечением фермента из крахмального блока может потребоваться идентификация соответствующей зоны с помощью специфической цветной реакции; далее зона вырезается и из нее элю-ируют белок. Во втором случае после окончания опыта разделенные компоненты получают с колонки простой элюцией. Описан также метод непрерывной элюции.

Однако ни крахмал, ни этанолизированная целлюлоза не являются абсолютно нерастворимыми, что создает трудности при выделении фермента. Кроме того, электрофоретическое разделение часто осложняется электроосмотическим перемещением растворенных веществ. Недавно в качестве поддерживающей среды для горизонтального электрофореза белков в блоке предложен поливинилхлорид [4346], а для электрофореза белков в вертикальных колонках — сефадекс [5074].

в) Зональный электрофорез в крахмальном геле позволяет лучше разделить вещества, чем электрофорез на упакованных в блоки порошках, поскольку в этом случае проявляется также эффект молекулярного сита. Этот метод, подробно описанный Смитом [4346], широко используется для аналитических целей, но возможности разделения с его помощью больших количеств белка ограниченны. Для препаративного электрофореза используют акриламидный гель; поскольку размер пор в этом геле можно варьировать, он имеет большие преимущества перед крахмальным. Были приложены значительные усилия для разработки систем, позволяющих увеличить количество вносимого белка, а также приемов для автоматического непрерывного количественного получения разделенных компонентов [1981, 4271]. Емкость геля по отношению к белкам зависит от его поперечного сечения; в препаративных опытах удается разделять несколько сот миллиграммов белка. Техника непрерывной элюции в процессе электрофореза состоит в собирании вытекающего раствора в небольшой ячейке, расположенной на одном конце геля; эта ячейка отделяется от прилегающего электродного резервуара полупроницаемой мембраной. Объем ячейки, в которой осуществляется элюция, должен быть небольшим; через нее непрерывно протекает буфер, используемый для элюирова-ния белков.

При электрофорезе в полиакриламидном геле можно улучшить разделение белков, используя градиент размера пор геля [3936].

«Изотахофорез» — название, данное недавно новому методу электрофоретического разделения ионизированных веществ. При изотахофорезе зоны разделяемых веществ оказываются между «ведущим электролитом», подвижность которого выше, чем подвижность любого из разделяемых ионов, и «замыкающим электролитом», подвижность которого в идеальном случае Глава 3

должна быть ниже подвижности разделяемых ионов. В равновесном состоянии все ионы движутся с одинаковой скоростью; в качестве «разделителей» между зонами используют амфоли-ты. В препаративных опытах в качестве поддерживающей среды используют полиакриламидный гель, а белковые фракции собирают с помощью проточной ячейки, как в обычно применяемом приборе для гель-электрофореза [1741].

г) Метод изоэлектрического фокусирования в стабилизированном градиенте рН позволяет разделять белки, отличающиеся по изоэлектрической точке всего на 0,01 единицы. В этом методе используют колонки, в которых находятся низкомолекулярные амфолиты в смеси с ферментом; в электрическом поле ам-фолиты мигрируют, создавая градиент рН, и индивидуальные белковые компоненты концентрируются, или «фокусируются», в зонах рН, соответствующих их изоэлектрическим точкам [1742]. При проведении опыта необходимо стабилизировать систему для защиты от конвекционных токов; обычно для этого в колонке создают градиент концентрации сахарозы или глицерина. Разделенные в градиенте плотности белки можно легко собрать с помощью коллектора фракций. Однако количество белка, которое может быть сфокусировано в одной зоне, ограничено, поскольку не исключены изоэлектрическая преципитация и локальная перегрузка градиента.

Изоэлектрическое фокусирование проводят также в геле, обычно для этой цели используют полиакриламидный гель. Данный вариант метода имеет преимущества перед методом, в котором ис

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.07.2018)