Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

щения. На рис. 3.1 приведена номограмма, с помощью которой можно определить количество соли, необходимое для перехода от одной степени насыщения к другой [1108]. Обычно при фракционировании сульфатом аммония за 100%-ное принимают полное насыщение при комнатной температуре, а не при 0°С.

В основе теории фракционирования ферментов высаливанием [1121] лежит хорошо известное уравнение

где s — растворимость фермента, выраженная в граммах на 1 л раствора; Г/2 —ионная сила в молях на 1 л раствора; р" и Ks — константы. При увеличении концентрации соли наступает момент, когда растворимость фермента соответствует его конГлава 3

центрации и фермент начинает выпадать в осадок. При дальнейшем повышении концентрации соли большая часть фермента переходит в осадок; обычно (в случае сульфата аммония) выпадение фермента в осадок в основном завершается при дальнейшем увеличении насыщения раствора на 5—10%. Точная концентрация соли, при которой начинается высаливание, определяется не только значением рН, температурой и природой соли, но также и концентрацией фермента. Таким образом, чтобы успешно повторить условия очистки по опубликованным данным, следует довести исходную активность фермента в растворе до тех же значений, с которыми работали авторы.

Обычно не стоит тратить время на повторное фракционирование сульфатом аммония в одних и тех же условиях несколько

Рис. 3.1. Номограмма для вычисления количества сульфата аммония, которое необходимо добавить, чтобы получить заданный процент насыщения [1108].

Выделение ферментов раз подряд. Однако, если при фракционировании варьировать рН или температуру, то порядок, в котором будут осаждаться различные белки, может существенно меняться, и в таком случае имеет смысл проводить последовательно фракционирование при различных условиях.

Д. ФРАКЦИОННАЯ АДСОРБЦИЯ

Это один из наиболее важных и ценных методов фракционирования ферментов. Фракционную адсорбцию можно проводить двумя способами: при первом способе последовательно при перемешивании вносят адсорбент в раствор фермента и затем каждую порцию отделяют центрифугированием. При втором способе ферментный раствор пропускают через колонку с адсорбентом и с помощью коллектора собирают фракции, как описано в разд. Е.

В первом методе если фермент адсорбируется, то его отделяют от других компонентов раствора, а затем экстрагируют или элюируют с адсорбента. Если же фермент не адсорбируется, то обработку адсорбентом можно использовать для удаления из раствора фермента большого количества балластных веществ.

В настоящее время в качестве адсорбентов используются главным образом гель фосфата кальция и гель гидроокиси алюминия Су; они имеют очень широкое применение1. Для адсорбции нежелательных примесей применяли древесный уголь [1118, 3267]; иногда используют другие адсорбенты, например

1 Приготовление геля фосфата кальция [2383]. 150 мл раствора хлористого кальция (132 г СаС12-6Н20 в 1 л) разбавить до 1600 мл водопроводной водой и встряхивать со 150 мл раствора трехзамещеяного фосфата натрия (152 г Na3P04-12H20 в 1 л). Реакцию среды довести до рН 7,4 разбавленным раствором уксусной кислоты, и образовавшийся осадок 3 или 4 раза промыть большим объемом воды (15—20 л), каждый раз сливая жидкость. Затем осадок промыть дистиллированной водой на центрифуге (выход сухого вещества 9,1 г). Мы суспендировали его в дистиллированной воде и оставляли стоять приблизительно в течение месяца. Затем слой прозрачной воды сливали, гель тщательно встряхивали и определяли вес сухого вещества в 1 мл. После этого препарат был готов к употреблению. Его следует хранить в темноте.

Приготовление геля гидроокиси алюминия Су [5107]. Растворить 300 г (NH4)2S04 в 6,5 л воды, нагреть до 60 °С и добавить 420 мл 20%-ного (по весу) NH3 (т. е. 77,5 г NH3; теоретически — 76,6 г). Раствор должен иметь слабощелочную реакцию в течение всей последующей процедуры осаждения. К нему прилить горячий раствор, содержащий 500 г A12(S04)3-18Н20 в 1 л воды, при энергичном перемешивании. Продолжать перемешивать в течение 15 мин, поддерживая температуру не ниже 60 °С. Разбавить взвесь до 40 л, дать осадку осесть (осаждение должно быть довольно быстрым) и жидкость слить. Промывание, повторить несколько раз, и каждый раз сливать водный слой; к четвертой промывной воде добавить 80 мл 20%-ного NH3. После 12— 20 промываний вода становится опалесцирующей; осадок промыть еще 2 раза и оставить на несколько недель для перехода Ga-формы в Су-форму. Глава 3

гель Zn(0H)2. Однако гель фосфата кальция, по-видимому, лучше других отвечает предъявляемым к адсорбенту требованиям.

Лучше всего адсорбция происходит в слабокислых растворах, при рН 5—6 и при низкой концентрации электролитов. Присутствие сколько-нибудь значительного количества солей обычно мешает адсорбции, поэтому в данном случае требуется большее количество адсорбента. В целях экономии адсорбента полезно предварительно проводить диализ. Описываемый метод фракционирования относится к числу быстрых, так как равновесие между адсорбентом и раствором наступает очень скоро, а для того, чтобы отцентрифугировать адсорбент, требуется всего несколько минут.

Процедура состоит в последовательном добавлении порций геля к раствору фермента, перемешивании полученной суспензии, центрифугировании и удалении каждой порции геля перед добавлением следующей. В отличие от других методов фракционирования активность фермента можно определить в небольших порциях основного раствора и таким образом удается прослеживать эффективность адсорбции фермента. В частности, при работе с фосфатом кальция нередко можно обнаружить, что первые порции адсорбента совершенно не адсорбируют фермент, но в то же время адсорбируют другие белки; затем сразу обычно в одной или двух порциях геля из раствора адсорбируется фермент, после чего остается неактивный раствор, который все еще содержит большое количество белка. Наибольшая степень очистки обычно получается в том случае, когда количество адсорбента добазлено с таким расчетом, чтобы первые (отбрасываемые) фракции удаляли около 10% фермента и 10% фермента оставалось в растворе после удаления из него активных фракций.

Далее необходимо элюировать фермент из адсорбента в активных фракциях. Если фермент не элюируется водой, то выгодно промыть гель, диспергируя его в воде и повторно центрифугируя. Для диспергирования геля в промывающих жидкостях или элюентах при работе с большими объемами требуется быстродействующая мешалка. Часто фермент элюируется слабощелочными растворами буферов, например фосфатным буфером с рН 7,6. Если же этим буфером не удается элюировать фермент, то это обстоятельство следует считать весьма благоприятным, так как при повторении элюции фосфатным буфером до прекращения перехода в раствор белка можно достигнуть более высокой степени дальнейшей очистки фермента. Элюцию большей части материала, оставшегося адсорбированным, почти всегда можно осуществить с помощью раствора фосфата, содержащего около 10% сульфата аммония [216]. Этот метод элюции •с успехом применялся в работе с различными ферментами. Объ-

Выделение ферментов

ем элюирующей жидкости не должен быть слишком большим и не должен превышать объема отцентрифугированного геля. Лучше проводить элюцию несколько раз малыми порциями, чем один раз большим объемом элюента.

Е. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В последние годы метод очистки ферментов путем хроматографии на колонках стал наиболее эффективным среди различных методов разделения. Вне зависимости от того, на чем основано разделение белков — на адсорбции, ионном обмене, избирательном сродстве к иммобилизованным лигандам или эффектах молекулярного сита, — техника работы во всех случаях практически одинакова. Процесс начинают с нанесения белка, растворенного в подходящем растворителе (буфере), на колонку, предварительно уравновешенную этим же растворителем. Затем через колонку пропускают либо определенный буферный раствор, либо извлекают белок ступенчато растворами элюента в возрастающей концентрации или же градиентной элюцией, или, наконец, специфическим для выделяемого фермента лиган-дом. Элюат собирают на коллекторе фракций. В получаемых фракциях определяют ферментативную активность и количество белка.

Гели, используемые для фракционирования методом адсорбции (разд. Д), не подходят для работы на колонках. Для хроматографии на колонках применяют специальные препараты. Так, можно, например, использовать определенные формы фосфата кальция, смешанные с суперцелем [4607], целлюлозой [3013] или целитом. Фосфат кальция может быть превращен в микрокристаллический гидроксилапатит1, который используют в колонках без добавления к нему какого-либо гранулированного материала.

В типичном опыте в колонку помещают гель фосфата кальция, смешанный с 5—10-кратным количеством (по весу) целита. Раствор белка перед нанесением на колонку следует развести

1 Приготовление гидроксилапатита [2774]. 2 л 0,5 М Na2HP04 и 2 л 0,5 М СаС12 слить со скоростью 15 мл/мин в 5-литровый сосуд при постоян

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.07.2018)