Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

и.

Г. экстракция

Когда подходящий источник фермента найден, фермент необходимо перевести в раствор. Для этого обычно требуется разрушить клеточную оболочку. Вообще говоря, из животных тканей экстрагировать ферменты легче, чем из микроорганизмов, и часто для извлечения ферментов из измельченной ткани мышцы или печени достаточна простая экстракция водой. При работе с тканью, для которой характерен интенсивный гликолиз, должны быть приняты меры, предупреждающие подкисле-ние, иначе может быть поврежден фермент. В таких случаях бывает целесообразно экстрагировать ткань буферным раствором. Иногда в целях более полной экстракции фермента необходимо тщательно измельчить ткань при помощи гомогенизатора с большим числом оборотов ножа или блендора Уоринга (хотя последним следует пользоваться с некоторой осторожностью).

Часто для разрушения клеточных оболочек приходится принимать более энергичные меры. Один из приемов, применяемых для механического разрушения ткани, состоит в растирании ее с песком или быстром встряхивании с измельченным стеклом; аналогично действуют звуковая или ультразвуковая вибрация, замораживание и оттаивание, обработка растворителями (таки-

Выделение ферментов ми, как ацетон), автолиз (либо сам по себе, либо в присутствии толуола, этилацетата или сульфида натрия) или лизис с помощью специально добавленных ферментов. Следует по возможности избегать предварительного автолиза ткани или ее обработки протеиназами в том случае, если пригодны какие-либо другие методы, так как в противном случае исследователь вынужден выделять фермент из чрезвычайно сложной смеси продуктов расщепления белков, возникшей в результате переваривания. Однако часто, особенно при обработке дрожжевых клеток, автолиз оказывается единственным методом, который можно применить в достаточно большом масштабе. Высушивание ткани ацетоном не только служит хорошим методом разрушения клеточной оболочки, но позволяет также заготовлять впрок активный обезвоженный порошок. Такой порошок может храниться достаточно долго; он представляет собой удобный исходный материал, из которого фермент можно экстрагировать водой или буферным раствором. Обработку ацетоном следует проводить при низкой температуре, но даже и в этих условиях некоторые ферменты разрушаются. Особый случай ферментативного лизиса представляет обработка лизоцимом (КФ 3.2.1.17) клеток Micrococcus lysodeikticus. Большинство приемов механического разрушения ткани малопригодны для работы с большими количествами материала.

Экстракция ферментов из субклеточных органелл представляет особую проблему. До недавнего времени ферменты митохондрий считались нерастворимыми и неотделимыми от самих митохондрий. Теперь мы знаем, что многие ферменты, находящиеся в митохондриях, свободно переходят в раствор, как только мембрана митохондрий оказывается поврежденной или приобретает проницаемость.

Однако некоторые ферменты прочно связаны со структурой митохондрий (возможно, в виде липопротеидного комплекса), и для их экстракции требуются специальные методы. В число этих методов входят: высушивание ацетоном, обработка материала смесью бутанола с водой, экстракция высушенных митохондрий различными органическими растворителями, экстракция водными растворами детергентов, таких, как холат, дезок-сихолат, твин, тритон, типол, эмазол и др.; обработка материала хаотропными агентами, такими, как перхлорат [1776], или обработка гидролитическими ферментами, например липазами, нуклеазами или протеолитическими ферментами.

При обработке бутанолом, дающей при выделении некоторых ферментов очень хорошие результаты и очень популярной {3270], по-видимому, разрушается липопротеидный комплекс, в результате чего фермент переходит в водную фазу. Обработка детергентом, широко используемая в последние годы, в частности при выделении компонентов дыхательной цепи, приводит Глава 3

иногда к истинному растворению фермента, который и после удаления детергента остается в виде прозрачного раствора (однако полностью удалить детергент, вероятно, невозможно); иногда всю процедуру очистки фермента приходится вести в присутствии детергента, в противном случае фермент выпадает в осадок.

МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

В получаемом экстракте помимо фермента, подлежащего очистке, присутствует и ряд других веществ большой и малой молекулярной массы. Малые молекулы могут быть удалены диализом или гель-фильтрацией, после чего в экстракте остаются крупные молекулы—преимущественно молекулы белков, хотя могут присутствовать и полисахариды. Очистка состоит в основном из серии фракционирований, при которых ферментный белок отделяется от других присутствующих в растворе белков. В прошлом использовали целый ряд различных методов фракционирования, но в настоящее время пользуются относительно небольшим числом стандартных приемов, которые оказались особенно эффективными и удобными.

Последовательность этих приемов определяют экспериментальным путем, но в общем можно сказать, что более быстрая очистка достигается сменой различных методов фракционирования, а не повторением однотипных операций.

Фракционирование обязательно должно контролироваться измерением активности фермента; далеко не всегда удается получить хорошие результаты, слепо следуя описанной методике.

Для каждой стадии очистки перед обработкой основной массы раствора проводят пробное фракционирование с небольшим количеством материала. В опытах с малыми объемами всегда необходимо иметь в виду задачу проведения данной операции в тех же условиях с большими объемами. Легко, например, прогреть несколько миллилитров раствора при 55 °С в течение 5 мин, но это невозможно сделать с 10 л раствора, так как очень трудно нагреть и охладить такой большой объем за такой короткий промежуток времени. Между тем, поскольку часто-требуется очистка фермента в несколько тысяч раз, на первых стадиях обычно приходится иметь дело именно с большими объемами жидкости.

При всех способах фракционирования следует уделять особое внимание двум факторам, которые весьма сильно влияют на результаты, а именно значению рН и концентрации электролитов (особенно первому из них). Большинство трудностей, встречающихся при попытках воспроизвести опубликованные результаты выделения, связаны с нарушением именно этих ус-

Выделение ферментов ловий. Для успешной работы незаменим хороший стеклянный электрод.

На каждом этапе фракционирования суммарный белок делится на ряд фракций (6—12 в предварительных опытах) путем постепенного увеличения концентрации соли, количества добавленного адсорбента, концентрации органического растворителя, кислотности и т. п. с таким расчетом, чтобы большая часть фермента попадала, если это возможно, в одну фракцию. Иногда для удаления балластных белков применяют также дробную денатурацию нагреванием или изменением рН.

Неправильно при фракционировании использовать несколько порций раствора фермента и добавлять к каждой из них иное количество соли или какого-либо другого осадителя. При таком фракционировании любой данный осадок будет содержать все белки, осажденные солью при данной концентрации; другими словами, он будет содержать все компоненты предыдущих фракций. И наоборот, правильно работать только с одной порцией раствора фермента, удаляя каждую предыдущую фракцию до осаждения следующей. При таком способе каждая фракция содержит только те белки, которые осаждаются при малых изменениях концентрации соли; иными словами, таким путем достигается истинное фракционирование.

При работе с большими объемами белковых растворов белки обычно не делят на столь же большое число фракций, как в пробном опыте. Как правило, получают только три фракции, из которых две отбрасывают. Если, например, пробное фракционирование показало, что осаждение изучаемого фермента начинается только после того, как концентрация сульфата аммония достигнет 66% насыщения, и что большая часть осаждается при 69%-ном насыщении, то основной раствор нужно сразу довести до 55%, осадок отбросить, затем довести раствор до 70%, осадок, содержащий фермент, сохранить и оставшийся раствор отбросить. Однако такое фракционирование без контрольных измерений активности фермента небезопасно, так как условия осаждения белков в больших объемах не полностью совпадают с условиями их осаждения при пробном фракционировании в малых объемах. На осаждение фермента может, например, влиять присутствие белков, которые в пробном фракционировании удаляются на предыдущих стадиях, но которые при работе с большими объемами могут вызывать осаждение фермента уже при 62% насыщения сульфатом аммония. По этой причине целесообразно провести еще одно пробное разделение— на этот раз только на три фракции — до того как приступить к фракционированию в большом объеме. Это позволит убедиться в том, что границы концентраций определены правильно. Глава 3

А. ФРАКЦИОННОЕ ОСАЖДЕНИЕ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ рН

При работе с экстрактами животных тканей часто бывает очень выгодно в качестве первой ступени (до начала основной очистки) довести реакцию среды до рН 5,0, о

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)