Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ощью этой же единицы. Концентрацию фермента в растворе выражают числом единиц в 1 мл; удельную активность фермента, которая является мерилом чистоты ферментного препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества.

До последнего времени удельную активность фермента выражали различными способами: числом единиц на 1 мг всего сухого остатка, на 1 мг всех органических веществ, на 1 мг

Выделение ферментов сухого остатка, не проходящего через мембрану при диализе, или, наконец, на 1 мг белкового азота. Согласно рекомендации Комиссии по ферментам, удельную активность ферментов следует выражать числом единиц в 1 мг белка. Такой способ выражения наиболее удовлетворителен, хотя он, очевидно, не дает верного представления о достигнутой степени очистки в том случае, если в исходном материале присутствует большое количество небелковых веществ (например, полисахаридов). Дрожжевой экстракт содержит, например, большое количество углеводов (гумми), которые осаждаются вместе с белками; однако освобождение от них не будет отражено при выражении степени очистки данным способом.

Количество белка можно определить несколькими методами, многие из которых обсуждаются Бэйли [237]. Классическим методом является определение общего азота по Кьельдалю [770]. Обычно белки содержат 15—16% азота, однако вклад в эту величину могут вносить и азотсодержащие вещества небелковой природы. Последнее обстоятельство причиняет особенно большое неудобство в тех случаях, когда для фракционирования пользуются сульфатом аммония; необходимость удалять небелковые примеси еще более замедляет и без того достаточно медленную процедуру, так как сжигание по методу Кьель-даля продолжается не менее 8 ч (для полного превращения азота всех аминокислот в аммиак).

Для измерения количества белка используют несколько колориметрических методов. Разработаны количественные методы, основанные на биуретовой реакции, при которой состав белка, очевидно, не должен сказываться на результатах определения, поскольку это реакция на пептидные связи, а не на боковые группы в белке. Метод Горнелла и соавторов [1618], основанный на измерении полосы поглощения в области 550—650 нм, используется для определения значительных количеств (1— 10 мг) белка в пробе. Предложены бнуретовые микрометоды, основанные на поглощении ультрафиолета медно-белковыми комплексами: они позволяют определять 0,1—2 мг белка в пробе [1592, 2166]. Число небелковых веществ, которые могут влиять на определения с помощью биуретовой реакции, невелико, но следует вносить поправки на те вещества, которые присутствуют в высокой концентрации, например трис, сахарозу или соли аммония [3956].

Метод Фолина и Чиокальто, предложенный для определения количества белка [2881], основан на хромогенной природе некоторых боковых групп аминокислот, а также на присутствии в белках пептидных связей. Поскольку аминокислотный состав белков колеблется в широких пределах, при определении этим методом количества разных белков возможны значительные вариации. Метод обладает высокой чувствительностью (на пробу

4—2277

so

Глава 3

достаточно 0,01—0,1 мг белка), но многие небелковые вещества мешают определению.

Ючау и Фоутс [2278] сравнили результаты, полученные при определении белков разными методами. Они исследовали разные фракции гомогената печени и обнаружили значительные расхождения в результатах.

В настоящее время для определения количества белка широко пользуются измерением интенсивности поглощения света при 280 нм, которое обусловлено присутствием в белке ароматических аминокислот. Количество этих аминокислот в разных белках различно, и поэтому интенсивность поглощения света у них неодинакова. Напомним, однако, что в сантиметровой кювете у раствора, содержащего 1мг «усредненного» белка в 1 мл, оптическая плотность при 280 нм равна 1. Нуклеиновые кислоты также поглощают при этой длине волны, но можно сделать приблизительную поправку на их присутствие, проводя измерения и при 260, и при 280 нм i[4989].

Ранее мы уже отмечали, насколько важна быстрота измерений активности ферментов. То же относится и к измерению количества сухого остатка или количества белка. Поэтому в процессе очистки предпочтителен быстрый метод определения белка путем измерения величины поглощения при 280 нм. Выиграть время важнее, чем исключить возможные ошибки за счет того, что удельное поглощение выделяемого белка иногда значительно отличается от средней величины поглощения смеси белков, присутствовавших в исходном материале. Если, однако, используется метод, при котором результаты определения зависят от присутствия какого-либо компонента в белке, то необходимо время от времени проверять, не произошли ли значительные изменения в среднем содержании этого компонента в ходе фракционирования. Такую проверку проводят, измеряя количество белка на главных этапах его очистки с помощью одного из наиболее надежных методов, таких, как биуретовый метод или определение азота по Кьельдалю.

Полезно при описании метода выделения фермента составить таблицу, по которой прослеживается процесс очистки на различных стадиях, эффективность различных операций, общая степень очистки и выход. Желательно, чтобы результаты были представлены в таблице стандартной формы. Вполне удовлет ворительна содержащая необходимые сведения приводимая ниже табл. 3.1, которая состоит из восьми столбцов. В столбце 1 дается краткое описание измеряемых фракций, в столбце 2 — их объем, в столбце 3 — концентрация фермента, в столбце 4 (цифры столбца 3, умноженные на цифры столбца 2) — общее число единиц фермента во всем объеме, в столбце 5 — концентрация белка, в столбце 6 (цифры столбца 3, разделенные на цифры столбца 5)-—удельная активность, в столбце 7 — выход

Выделение ферментов Таблица 3J

Очистка изоцитратдегидротеназы (NADPH+) (КФ 1.1.1.42) из печени свиньи [2121]1»

Фракция или процедура Объем, мл Концентрация, ед./мл Общее число единиц Концентрация белка, мг/мл Удельная активность Выход, % Степень очистки

Гомогенат 7000 2,85 19 950 35,5 0,08 (100) (1,0)

Осаждение хлороформом (супернатант) 5800 3,6 20 880 19,2 0,187 105 2,34

Осаждение (NH4)2S04 (фракция между 37,5 и 55% насыщения, диализованная) 1500 11,25 16 875 21,4 0,525 84,5 6,5&

Фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе 2380 •3,82 9 090 1,0 3,82 45,5 47,7

Фракционирование на колонке с фосфатом кальция 450 15,05 6 772 0,9 16,7 34 209

Гель-фильтрация, элю-ция изоцитратом 52 98 5 096 2,15 45,6 25,5 570

'> Эта таблица дана как иллюстрация стандартного способа изображения результатов очистки; приведенные в ней цифры отражают реальный эксперимент. Описание процесса очистки значительно сокращено. Для воспроизведения этого процесса следует обратиться к оригинальной статье.

(цифры получены из цифр столбца 4 при условии, что активность исходного экстракта принята за 100%), в столбце 8 — степень достигнутой очистки (цифры получены из цифр столбца 6 при условии, что первая цифра этого столбца равна 1).

В табл. 3.1 приведен пример типичной очистки фермента. Чаще всего число этапов разделения при очистке фермента приближается к 6, и на каждом этапе чистота фермента возрастает в среднем в 3 раза, хотя, естественно, возможны варианты. Общая степень очистки постепенно возрастает в несколько сотен и даже тысяч раз, а общий выход чистого фермента обычно составляет всего ~5%. В том случае, когда исходный материал достаточно доступен, низкий выход фермента не имеет особого значения.

В. ИСТОЧНИК ФЕРМЕНТА

После того как избран удовлетворительный метол}, определения активности фермента, полезно потратить некоторое количество времени на поиски источника, богатого данным ферментом,

4* Глава 3

если, разумеется, нет особых причин для получения его только из какого-нибудь вполне определенного источника. Количество данного фермента в различных тканях может сильно варьировать (табл. 12.3). При работе с тканью, богатой ферментом, не только получают больше фермента, при этом для получения чистого препарата достаточна в 10 и даже в 100 раз меньшая степень очистки. Естественно, следует отдавать предпочтение легко доступным источникам.

При работе с бактериями, которые обычно трудно получать в больших количествах, можно использовать феномен индукции фермента. Если выращивать бактерии на среде, содержащей соответствующий субстрат, то получают культуру, значительно обогащенную данным ферментом.

Многие ферменты сосредоточены в особых клеточных структурах, например в митохондриях. Поэтому в некоторых случаях имеет смысл сначала выделить митохондрии скоростным центрифугированием тканевых экстрактов и затем использовать их в качестве исходного материала. При этом удаляются ферменты, а также другие компоненты цитоплазмы и достигается значительная степень очистки еще до применения обычных методов фракционирования. Однако для получения митохондрий в больших количествах необходимы большие высокоскоростные центрифуг

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2018)