Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

я сотнями, и для того, чтобы тщательно изучить каждый отдельный фермент, его прежде всего нужно очистить?"-Мтзжно^ конечно, в некоторых случаях, пользуясь достаточно специфическими методами определения активности, исследовать и неочищенные ферменты. Так оно и бывало в действительности. Исследования по биохимии ферментов начались задолго до того, как были получены первые чистые ферменты. Однако в большинстве случаев примеси других ферментов мешают глубокому изучению выделяемого фермента. Иногда они действуют на субстрат, и тогда появляются продукты побочных реакций, а иногда — на продукт реакции, который превращается в какое-либо другое вещество; могут действовать они также на кофермент и даже на сам фермент. Поэтому до тех пор, пока фермент не получен в чистом виде, трудно с уверенностью сказать, какую именно реакцию он катализирует. -—— -*

Часто постге очистки ферментов обнаруживают, что реакции, казавшиеся простыми, на самом деле включают несколько отдельных этапов, причем каждый из этапов катализируется своим особым ферментом. Гипотетические схемы различных метаболических процессов обычно остаются неясными и полными противоречий до тех пор, пока благодаря получению в чистом виде ферментов, участвующих в том или ином процессе, не разъяснится его механизм. Примером может служить-^щкл лимонной кислоты, механизм которого стал ясен только тогда, когда удалось выделить фермент, катализирующий образование

цитрата (КФ 4.1.3.7). --"

Для изучения свойств и поведения фермента как химического катализатора, необходимо иметь ферментный препарат очень высокой степени чистоты. Это особенно важно при исследовании его специфичности, ибо если обнаруживается, что неочищенный препарат катализирует какую-либо дополнительную реакцию, то всегда остается сомнение, не вызвано ли это примесью другого фермента в препарате. В настоящее время уже Глава 3

нет нужды особо подчеркивать, насколько важно работать с чистыми ферментами.

Ферменты представляют интерес не только как химические катализаторы, которые можно выделить, но главным образом как компоненты метаболического аппарата живой клетки. Окружающая фермент среда в пробирке сильно отличается от окружающей его естественной среды в клетке, и нельзя не принимать во внимание, что это отличие может влиять на поведение фермента. Очистка фермента может сказываться на его активности различным образом. Очевидно, что в результате очистки могут быть удалены какие-то кофакторы, существенные для катализа, но их можно добавлять при определении активности фермента. В некоторых случаях роль кофакторов могут играть (помимо специфических коферментов) структурные компоненты клетки, такие, как мембраны, содержащие липиды; например, очищенная 3-гидроксибутиратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.30) активна только после добавления липида [1371], а свойства некоторых других ферментов при взаимодействии с мембранами внутри клетки, по-видимому, модифицируются [2207, 2903]. Иногда свойства фермента меняются под влиянием операций, используемых при очистке, особенно при нагревании, которое в ряде случаев применяется как стадия очистки. Сказанное относится к ряду регуляторных ферментов [4445]; так, некоторые свойства сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1) меняются при переводе ее в раствор [1513], а некоторые приемы очистки, по-видимому, способствуют частичному протеолитическому расщеплению и изменению свойств фруктозо-бисфосфатазы (КФ 3.1.3.11) [4787].

В общем можно сказать, что исследование изолированных ферментов пролило свет на их каталитический потенциал внутри клетки и чго отличия, наблюдающиеся между ферментами внутри клетки и ферментами, выделенными из клетки, вероятнее всего обусловлены факторами проницаемости или влиянием других компонентов системы, а не модификацией ферментов в процессе очистки. Было бы, однако, неверно думать, что естественное окружение фермента несущественно для его активности.

Целенаправленную очистку ферментов начали проводить с 1922 г.; первый кристаллический фермент уреаза (КФ 3.5.1.5) был получен Самнером [4575] в 1926 г.; к 1940 г. число ферментов, полученных в высокоочищенном виде, приблизилось к 20, и с тех пор оно продолжает увеличиваться. Ежегодно поступают сведения об очистке десятков новых ферментов, и в настоящее время общее число очищенных ферментов измеряется многими сотнями. Далеко не все они получены в кристаллическом виде, хотя некоторые некристаллические препараты, возможно, чище кристаллических; известно, что кристаллизация белка не гарантирует его чистоты, и часто в первых полученных

Выделение ферментов кристаллах белка чистота не превышает 50%. В списке ферментов, помещенном в конце третьего тома, приведено около 200 различных ферментов, полученных в кристаллической форме; однако мы допускаем, что нам известны не все такие ферменты.

МЕТОДЫ ОЧИСТКИ

По данному вопросу много полезных сведений собрано в обзоре Швиммера и Парди [4168], вышедшем в 1953 г. К этому обзору мы и отсылаем читателя за более подробной информацией.

Для удобства изложения предположим, что открыт какой-то новый фермент и что нам предстоит выделить его в чистом виде.

А. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

Первое, что необходимо сделать перед тем, как приступить к работе по очистке данного фермента, — это подобрать количественный тест для определения его активности. Поскольку при выделении фермента большая часть времени уходит на определение активности во множестве различных фракций, желательно как-то по возможности ускорить эту процедуру. В данном случае быстрота определений более важна, чем высокая точность. В процессе фракционирования метод определения активности, требующий 5 мин и дающий точность 5%, предпочитают методу, требующему 30 мин и дающему точность 0,5%.

Выбор метода, естественно, зависит от типа реакции, катализируемой ферментом, и в каждом конкретном случае должен быть разработан подходящий тест. В гл. 2 приведено несколько методов, используемых при выделении ферментов.

Одно из наиболее часто встречающихся затруднений при разработке теста состоит в том, что система может оказаться более сложной, чем это представляется на первый взгляд. Допустим, например, что в процессе ферментативной реакции субстрат А превращается в вещество В и тест основан на определении этого вещества В. В действительности вполне может оказаться, что превращение идет с образованием незамеченного нами промежуточного продукта С и что в процесс фактически вовлечены два фермента: один превращает вещество А в С, а другой превращает С в В. В таком случае на той ступени очистки, на которой эти два фермента разделяются, обнаружится общее уменьшение активности при использовании данного теста. Картина может разъясниться, если при соединении неактивных фракций вновь появится активность. Следовательно, данный тест должен быть заменен тестом, позволяющим измеГлава 3

рять количество вещества С; тогда первый фермент можно очистить независимо от второго или, если это окажется неудобным, можно приготовить препарат второго фермента и добавить его в избытке ко всем пробам в качестве одного из реагентов.

Аналогичная картина наблюдается, когда в реакции, катализируемой простым ферментом, участвует кофермент, о присутствии которого в данной системе мы не знали. И в этом случае активность при очистке исчезает. Если удаленный фактор окажется одним из известных коферментов, то его можно просто добавить в пробы; если же природа кофермента неизвестна, то активность фермента может восстановиться добавлением к нему либо прокипяченного тканевого экстракта (кипячение служит для удаления ферментов и белков, так как большинство коферментов относительно теплоустойчивы), либо трихлорук-сусного экстракта (нейтрализованного), либо, наконец, диализата (молекулы большинства коферментов сравнительно невелики и проходят сквозь целлофановые мембраны).

Б. ОБЩИЕ ПРИЕМЫ

Так как мы предположили, что изучаемый нами фермент ранее не был очищен, его удельная активность, а следовательно, и чистота исходного препарата, естественно, нам неизвестны. Фермент может присутствовать в ткани в количестве, составляющем от 7ю До Vio ооо части всего материала. Поэтому необходимо иметь такую произвольно выбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения. Если это спектрофотометрический метод, то такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; если определяется какой-то продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в минуту, и т. д. В интересах единообразия желательно выбрать такую единицу, которая, насколько это возможно, соответствует рекомендациям Комиссии по ферментам (гл. 2). После того как выбрана единица фермента, другие показатели могут быть выражены с пом

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)