Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

е, сопровождаемое образованием водородного иона, можно измерять манометрически в бикарбонатном буфере [3768].

Манометрические методы подробно рассматриваются в ряде работ [1107, 4843]. При определении потребления Ог они постепенно вытесняются методом с использованием кислородного электрода.

Г. ЭЛЕКТРОДНЫЕ МЕТОДЫ 1

Использование стеклянного электрода дает в руки исследователя другой метод изучения тех реакций, в результате которых образуется кислота. Наиболее простым приемом является регистрация изменений рН в ходе реакции, однако против него имеются два возражения. Во-первых, изменение рН в ходе реакции можег, вероятно, вызывать осложнения, связанные с изменением активности фермента. Во-вторых, скорость изменения рН зависит не только от скорости реакции, но также и от буферной емкости раствора. Последнее обстоятельство представляет серьезное затруднение, так как белки обладают высокой буферной емкостью. Неочищенные же препараты фермента содержат значительное количество неактивного белка, который удаляется в ходе очистки, в результате чего изменяется буферная емкость изучаемых препаратов.

Значительно большими преимуществами обладает метод непрерывного титрования. В этом случае с помощью частых добавлений небольших количеств щелочи поддерживают приблизительно постоянный уровень рН; скорость добавления щелочи отражает скорость реакции и не зависит от количества буфера. Количество буфера влияет, однако, на точность метода: если буфера берут слишком мало, то трудно поддерживать рН на постоянном уровне, если же его берут слишком много, то метод становится нечувствительным.

В продаже имеются очень удобные автоматические приборы (рН-статы), в которых поддерживается постоянное значение рН за счет непрерывного добавления кислоты или щелочи и в то же время вычерчивается кривая, показывающая количество доГлава 2

бавленного реактива во времени. С помощью такого прибора получают кривые хода реакций для многих ферментов. Имеется прекрасный обзор по использованию рН-стата [2179].

Реакции, в которых участвует 02, удобно изучать полярографическим методом. Сила тока, проходящего через поляризованный платиновый электрод, зависит от концентрации 02 в растворе, в который погружен электрод, и при непрерывном измерении можно получать кривую, показывающую изменение концентрации 02. Для этой цели используют кислородные электроды двух типов. Чане [728] в большинстве своих работ по окислительному фосфорилированию пользовался вибрирующим платиновым электродом, погруженным непосредственно в реакционную смесь. Электрод Кларка отделен от реакционной смеси полиэтиленовой мембраной, через которую способен диффундировать молекулярный кислород. Этот электрод в последнее время все более широко применяется при изучении окисления субстратов суспензией митохондрий и сходными системами; описание техники работы с этим электродом приведено в работе Чеппела [738]. Полярографический метод отличается от манометрического тем, что жидкость находится в закрытой системе без газовой фазы.

Исследование окислительных ферментов, которые не взаимодействуют с 02, нередко удается осуществить при добавлении к системе подходящего акцептора водорода и измерении его окислительно-восстановительного потенциала с помощью гладкого платинового электрода, потенциал которого зависит от отношения концентраций восстановленной и окисленной форм акцептора. Восстановление акцептора прослеживается по изменению потенциала электрода.

Имеется также электрод для измерения концентрации С02 [4005, 4207], однако время установления потенциала на этом электроде весьма велико, поэтому он не может быть использован при исследовании быстро протекающих реакций.

Д. ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Многие ферменты действуют только на один из оптических изомеров своих субстратов. Если, как это часто имеет место, продукт реакции оптически неактивен, то за ходом реакции следят по изменению оптического вращения. С аналогичным положением мы сталкиваемся и в том случае, когда субстрат оптически неактивен, но в ходе реакции образуется оптически активный продукт или когда и субстрат, и продукт оптически активны, но значительно различаются по величине удельного вращения. Этот метод, хотя и не столь удобный, как другие, все же может быть использован при изучении ряда ферментов, по отношению к которым другие методы неприменимы, особенно при

Методика работы с ферментами изучении ферментов, действующих на углеводы. Классическим примером может служить fj-фруктофуранозидаза (КФ 3.2.1.26). При работе поляриметрическим методом опыты проводят в термостатированной поляриметрической трубке.

В некоторых случаях оптическая активность субстрата слишком мала для того, чтобы ее можно было непосредственно измерить, но иногда она значительно возрастает в результате образования комплексного соединения. Именно так обстоит дело с оксикислотами, например с яблочной кислотой, которая образует комплексы с молибдатом, характеризующиеся высокими значениями удельного вращения. Впервые таким путем изучали фумаразу, но так как катализируемая ею реакция не протекает в присутствии молибденового реагента, необходимо было отбирать пробы по ходу реакции. В связи с тем что это довольно сложная процедура, в настоящее время этот метод уступил место более быстрым спектрофотометрическим методам.

Е МЕТОДЫ С ОТБОРОМ ПРОБ

Многие ферментативные реакции изучают, отбирая пробы через определенные промежутки времени и определяя количество субстрата или продукта химическими методами. По этому поводу можно сделать мало каких-либо общих замечаний, так как различные ферменты требуют разных методов определения. Существует, однако, несколько методов более общего характера, применимых к целым классам ферментов. Удобный колориметрический метод Фиске и Суббароу [1356] для определения неорганического фосфата находит широкое применение, так как в очень многих ферментативных реакциях участвуют различные фосфорные соединения. Таким путем можно непосредственно изучать фосфатазы, фосфорилазы и нуклеотидазы. Кроме того, пирофосфатные связи расщепляются за 10 мин в результате гидролиза в 1 н. НС1 при 100 °С, и выражение «10-минутный фосфор» стало общепринятым, когда говорят о неорганическом фосфате, освобождающемся под влиянием такой обработки. Это позволяет исследовать многочисленные реакции, в которых участвуют АТР или ADP, в том числе и реакции, катализируемые некоторыми киназами и синтетазами, так как АТР имеет две пирофосфагные связи, a ADP — только одну.

Поскольку расщепление гликозидной связи приводит к образованию восстанавливающей группы, при изучении ферментов, действующих на углеводы, широко используются методы, связанные с восстановлением меди.

Как показал Липман, добавление гидроксиламина к ацил-фосфатам приводит к образованию гидроксамовой кислоты, которая дает пурпурное окрашивание с солями окисного железа. Таким путем можно определять ацетилфосфат, и при изучении

•44

Глава 2

ферментативных реакций с участием ацетил-СоА к реакционной смеси добавляют СоА и избыток фосфат-ацетилтрансферазы (КФ 2.3.1.8). Например, цитрат (si)-синтаза (КФ 4.1.3.7) образует цитрат из оксалоацетата и ацетил-СоА, и если вместо ацетил-СоА добавить ацетилфосфат, СоА и фосфат-ацетилтранс-феразу, то за реакцией можно следить по исчезновению ацетил-фосфата [3502].

В ряде случаев, когда другие методы не позволяют получить необходимые данные, образование продукта удается обнаружить с помощью хроматографии. Это, по существу, метод отбора проб: через определенные интервалы времени из реакционной смеси берут пробы, наносят на хроматографическую бумагу, высушивают и проводят хроматографию. Появление и увеличение (в последовательных пробах) размера нового пятна позволяет качественно оценить протекание ферментативной реакции. Если необходимы количественные данные, то пятна вырезают, экстрагируют вещества и определяют их количество подходящим химическим или спектрофотометрическим методом. Иногда используют также субстраты, содержащие радиоактивные изотопы; количество радиоактивного продукта в пятне определяют с помощью счетчика. В некоторых случаях для отделения меченого продукта вместо хроматографии можно применять экстракцию органическими растворителями.

Главный недостаток хроматографического метода заключается в том, что вся процедура в целом занимает слишком много времени; особенно много времени — несколько часов — требуется для хроматографирования. Выделение фермента, при котором ход очистки контролировался бы с помощью такого метода, было бы, несомненно, очень медленным и трудоемким делом. По этой причине хроматографические методы не нашли очень широкого применения при работе с ферментами, за исключением тех случаев, где другие методы непригодны.

Для подробного ознакомления с методами изучения отдельных ферментов см. серийное издание «Методы энзимологии» [846].

Глава 3

Выделение ферментов

ЗНАЧЕНИЕ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты встречаются в природе в виде сложных смесей в клетках, где обычно число их измеряетс

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.09.2018)