Биологический каталог




Биохимия природных пигментов

Автор Г.Бриттон

В некоторых случаях триплетное состояние, подобно возбужденному синглетному, возвращается в основное состояние (50) путем перехода, сопровождающегося излучением энергии (7"i—ь$о), правда, вероятность этого процесса мала. Поскольку изменение энергии при таком переходе невелико, испускаемый свет имеет значительно большую длину волны как по сравнению с поглощенным, так и по сравнению со светом, испускаемым в виде флуоресценции; такое выделение энергии называется фосфоресценцией. Поскольку переход 7\—KS0 имеет низкую вероятность и триплетное состояние может быть долгоживущим, фосфоресценция может продолжаться в течение нескольких секунд, т. е. значительно дольше, чем флуоресценция, которая обыкновенно протекает в течение 10~9—10~7 с после исходного поглощения света.

В биологических системах потеря избытка энергии в результате процессов, не сопровождающихся испусканием излучения, имеет особое значение. Избыток энергии может быть перенесен как от молекул в синглетном возбужденном состоянии Si, так и от молекул в более долгоживущем триплетном состоянии Т\ на другие близко расположенные молекулы и может использоваться для осуществления химических реакций. Именно такие процессы, не сопровождающиеся излучением или испусканием света, обусловливают превращение поглощенного света в химическую энергию при фотосинтезе, а также множество других важных реакций в биологических тканях (гл.9—11).

1.5. Спектроскопические методы исследования природных пигментов

Из приведенного выше краткого обсуждения ясно, что при изучении природных пигментов поглощение света имеет фундаментальное значение. Спектроскопия электронного поглощения, с помощью которой регистрируют поглощение УФ-и видимого света, является основным спектроскопическим методом, применяющимся как для выявления свойств пигментов, так и для их количественного анализа. Однако специфические свойства пигментов в отношении поглощения света позволяют исследовать их и другими методами, главным образом резонансной рамановской спектроскопией и методом кругового ди-хпоизма. Так же как и при изучении других органических молекул, чрезвычайно полезными могут оказаться и методы инфракрасной (ИК) спектроскопии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии.

1.5.1. Спектроскопия поглощения видимого света

Природные пигменты по приведенному выше определению поглощают свет в видимом диапазоне спектра электромагнитного излучения, т. е. между длинами волн 380 и 750 нм. Поэтому их спектр поглощения видимого света имеет по крайней мере один максимум поглощения при длине волны (лШах), характерной для хромофора молекулы пигмента. Это свойство, а также общая картина спектра дают полную информацию о молекулярной структуре и обычно используются при первых попытках идентифицировать пигмент. Положение Хшах сильно зависит от используемого растворителя, а у некоторых групп пигментов и от величины рН. На спектры поглощения пигментов in vivo часто влияет ближайшее микроокружение молекулы.

Подробно свойства спектров поглощения света различными группами пигментов, а также некоторыми индивидуальными пигментами будут приведены в соответствующих главах этой книги.

При исследовании функционирования пигментов применяют ?очень сложные модификации основного спектроскопического метода измерения поглощения света. Такие модификации позволяют изучать очень быстро протекающие процессы (в течение пико- или наносекунд). Исследуемую систему периодически освещают короткими интенсивными вспышками света и затем регистрируют изменения в спектре поглощения. Подобные методы позволили получить очень ценную информацию при исследовании первичных реакций фотосинтеза.

1.5.2. Количественный спектрофотометрический анализ

Спектры поглощения света чрезвычайно ценны также для точного, чувствительного и воспроизводимого количественного анализа пигментов. Интенсивность полосы поглощения при какой-либо длине волны регистрируют экспериментально как абсорбцию, экстинкцию, поглощение, или оптическую плотность раствора. Она прямо пропорциональна как концентрации пигмента в растворе, так и расстоянию, проходимому светом через раствор (законы Ламберта — Бэра).

При таком анализе используются два коэффициента. Коэффициент молярного поглощения (или экстинкции) определяется как поглощение света 1 М раствором вещества при длине светового пути через раствор 1 см. Коэффициент удельного поглощения (или экстинкции) AiCMI% или (Ei см1 )—это поглощение света 1%-ным (вес/объем) раствором вещества при длине светового пути 1 см. Для большинства групп природных пигментов существуют справочные таблицы этих коэффициентов.

Зная стандартный коэффициент поглощения, концентрацию любого раствора можно определить по величине его поглощения. Так, количество х г пигмента в у мл раствора находят по формуле

где Л — измеренная величина поглощения света раствором.

1.5.3. Дифференциальные спектры

Два образца одного и того же вещества, находящиеся в разных условиях, могут иметь несколько разные максимумы поглощения, а также несколько разные интенсивности поглощения, но эта разница столь мала, что ее трудно заметить при изучении этих спектров по отдельности. Однако вариации в этих величинах гораздо легче уловить, если один из образцов использовать в качестве стандарта, против которого снимается спектр другого образца. Получаемые при этом дифференциальные спектры являются очень высокочувствительным средством, с помощью которого обнаруживают небольшие изменения в светопоглощающих свойствах. Например, дифференциальные спектры «свет — темнота», в которых сравнивают поглощение света освещенным образцом и образцом, содержащимся в темноте, оказались чрезвычайно ценными при выявлении незначительных изменений этой величины, которые имеют место при освещении фотосинтезирующих тканей или частиц. Дифференциальные спектры окисленных и восстановленных форм были использованы для получения информации об участии цито-хромов в цепи переноса электронов и об окислительно-восстановительном состоянии отдельных цитохромов в определенных условиях. С помощью этого основного метода и многих его изощренных модификаций мы узнали очень много нового о физических состояниях пигментов и их функционировании в фотосинтезе и транспорте электронов.

1.5.4. Рамановская спектроскопия

С помощью рамановской спектроскопии регистрируют изменения колебательной и вращательной энергии, причем для возбуждения таких изменений используют поглощение УФ- и видимого света. Когда монохроматический свет проходит через образец, некоторое количество света рассеивается под прямым углом к падающему лучу. При изучении этого процесса было обнаружено, что длина волны рассеянного света отличается от длины волны падающего света, поскольку в колебательной и вращательной энергии молекул за то короткое время, в продолжение которого фотоны падающего света «улавливаются» молекулами образца, происходят определенные изменения. В силу этого величины длин волн соответствуют поглощению или испусканию ИК-излучения. Получаемый при этом спектр содержит ряд полос поглощения (рамановских линий), каждая из которых соответствует отдельному типу колебаний в молекуле, например колебания валентной связи С —С обусловливают полосу поглощения при 1500 см"1. Важно, однако, что ИК-поглощение и рамановские спектры никогда не бывают идентичными. Различия между ними могут давать ценную информацию о молекулярной симметрии, так как симметричная молекула или колебание не дает полосы в ИК-спектре поглощения, но может давать сильную рамановскую полосу.

При работе с пигментами обычно применяется резонансная рамановская спектроскопия. Когда длина волны падающего, или возбуждающего, света приближается к той, при которой происходит максимальное поглощение света образцом, улавливание кванта света становится гораздо более вероятным. Поэтому рассеяние света значительно увеличивается, а интенсивность рамановских линий сильно возрастает. В образце, содержащем смесь соединений, резонансное усиление регистрируется только для тех рамановских линий, которые обусловлены колебаниями молекул, возбужденных падающим УФ- или видимым светом. При этом получают информацию об определенных молекулах, поглощающих свет; другие молекулы, которые не поглощают свет возбуждающей длины волны, не дают резонансно-усиленных рамановских линий. Резонансный раманов-ский метод, таким образом, особенно ценен для исследования пигментов in situ. Пигменты, находящиеся в панцире, коже и т. п., могут быть обнаружены и количественно изучены с помощью этого метода без предварительной экстракции из ткани и очистки от примесей.

Другой областью применения этого, метода является исследование взаимодействий пигмент (хромофор) — белок, поскольку в этом случае метод позволяет получить избирательную информацию о хромофорной молекуле без разрушения комплекса. В частности, можно обнаружить переход хромофорной молекулы в основное состояние, который происходит при связывании с белком или в результате других изменений в ее микроокружении. Таким образом можно изучать свойства хромофоров в их природном окружении. Этот подход оказался чрезвычайно полезным при изучении связывания ретинальдегида с опсином в зрительных пигментах (гл. 9).

1.5.5. Линейный дихроизм

В предыдущих разделах все рассуждения о поглощении света относились к естественному неполяризованному свету. Однако не менее ценную информацию можно извлечь также из феноменов, связанных с поглощением поляризованного света.

Согласно электромагнитной теории, световая волна состоит из электрических и магнитных векторных компонентов, которые находятся под прямыми углами друг к другу и к направлению распространения волны. Частота колебаний является частотой излучения. Свет, испускаемый природным источником или обычной лампой накаливания, неполяризован. Однако если его пропустить через поляризатор, то пройдет лишь свет с определенной ориентацией электрических и магнитных векторов. Пигмент, у которого хромофорные группы расположены беспорядочно, будет поглощать свет определенной длины волны независимо от того, поляризован све

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67

Скачать книгу "Биохимия природных пигментов" (3.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)