а, зараженных изолятом 204-1 вируса желтой мозаики сои, установили, что катодный изоэнзим пероксидазы «С2» оказывает модифицирущее действие на метаболизм клетки, способствуя локализации вируса в местах его проникновения. Исследователи установили принадлежность к одной группе сцепления генов гены, отвечающие за синтез катодного изоэнзима «С2» и за признаки сверхчувствительности к заражению вирусом. Авторы предлагают этот изоэнзим пероксидазы использовать как генетический маркер при селекции красного клевера на устойчивость к этому вирусному заболеванию.

Изложенное выше свидетельствует о том, что, используя перокси-дазные маркеры, удается более полно характеризовать защитные механизмы растений и найти подходы для диагностики устойчивости к вирусам у разных сортов сельскохозяйственных культур, что позволяет вести селекцию на основе определенной научной объективности.

ГЛАВА 3

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ ИММУННОГО ОТВЕТА 3.1. ПРИНЦИП ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ

Иммунитет любой системы — это способность организма идентифицировать, нейтрализовать и удалить чуждые структуры в целях сохранения собственной целостности. Иммунологический контроль животных делится на клеточный и гуморальный (антитела), где общая система функционирует как единое целое. В животном организме лимфоциты (1012) и иммуноглобулины (1012 молекул) призваны распознавать антигены. Антигенами могут быть молекулы и клетки, не принадлежащие организму или образовавшиеся из собственных метаболитов в результате их

27

физиологического или патологического изменения. Обнаружив (как?) антиген, иммунная система должна его обезвредить. Для этой цели в организме действуют сопряженно Т-клетки, антитела и В-клетки [Петров, 1982]. Фагоцитоз и внутриклеточное разрушение антигенов производят макрофаги.

Иммунная система животных реализуется таким образом, чтобы ответная реакция наступала в нужный момент, была направлена на определенный антиген, была адекватна и строго ограничена во времени. Такая защитная функция возникла давно в процессе эволюции из клеток двух типов —лимфоцитов н макрофагов. Если эти условия защиты в силу определенных причин не могут обеспечить устойчивое состояние организма, он заболевает и погибает. Чтобы предотвратить заболевание, антиген метится специфическим антителом и присоединяется к Т-клетке или макрофагу. Роль макрофагов состоит в превращении антигенов в иммуноген, т. е. в соединение, способное индуцировать образование антител, и т. д. Механизм этого процесса и природы иммуногенов пока до конца не выяснены.

Для растений все обстоит несколько иначе. Однако сравнительно давно существует мнение, что в растительном организме также возникают белки, подобные антителам, но продолжительность их жизни сравнительно невелика [Сухорукое, 1986].

Взаимодействие по типу антиген—антитело основано на ионной связи, сущность которой состоит в возникновении положительно и отрицательно заряженных -ионов. Прочность связи между антигеном и антителом невелика и занимает промежуточное положение между прочностью водородной связи "и гидрофобных взаимодействий. Такие полярные связи осуществляются между ионизирующимися группами пептидных цепей как внутри одной молекулы, так и между различными молекулами, а также при взаимодействии макромолекул с низкомолекуляриыми органическими и неорганическими ионами. Взаимодействие последнего типа вполне может осуществлять фермент пероксидаза, имеющий в своем составе реакционноспособные СООН, NH2- и SH-группы.

Поскольку антигенами могут быть самые различные соединения, вполне возможно, что пероксидаза при участии своих субстратов — фенолов, аминосоединений и перекиси водорода — может выполнять окислительно-восстановительный акт, в результате которого идет утилизация ненужных клетке соединений. Это подтверждается тем, что фермент отличается очень широкой субстратной специфичностью и диапазон субстратов до конца не выяснен. Например, пероксидаза хрена может окислять ароматические диамины до реакционноспособных хинондииминов [Claiborne, Fridovich, 1979], которые вступают в реакцию с белками и дают конъюгаты этих аминов.

В основе образования конъюгатов лежит следующий принцип. Окисление фенолов и ароматических аминов, катализируемое пероксидазой, протекает по свободнорадикальному механизму с образованием хино-нов [Саундерс, 1978]. При этом как промежуточные свободные радикалы, так и хиноны обладают высокой реакционной способностью. Первые могут ковалентно связываться с цистеином, тирозином и гистидином белков, вторые активно реагируют со свободными амино- и тиольными

28

группами белков. Таким образом, фермент осуществляет биоактивацию антигенов за счет своих субстратов и перекиси водорода, подготавливая их для конъюгации с другими носителями: белками, полисахаридами, гликопротеинами и др. [Ковалев, Полевая, 1985]. Авторами показана принципиальная возможность образования конъюгированного антигена (о-аминоазотолуол — бычий сывороточный альбумин) ферментативным методом с помощью пероксидазы хрена. Аналогичные конъюгаты были также получены и с пероксидазой сыворотки крови. На предложенной ими схеме представлены конъюгированные антигены и указаны возможные участки связывания их с белком:

СН3 СН3

'Другие возможные участки присоединения

Комплексы конъюгированных антигенов в организме животных индуцируют синтез антител, специфически связывающих антигены [Ковалев, и др., 1984]. Такого типа иммунологический контроль является общей функциональной системой, обеспечивающей утилизацию антиметаболитов. При этом биоактивация в присутствии пероксидазы—Н2О2 различных соединений свидетельствует о необходимости функционирования окислительной системы в защитных реакциях организма. Получение конъюгированных антигенов с пероксидазой как растительного, так и животного происхождения определяет принципиальную возможность участия этого фермента в иммунологическом контроле живых организмов. Если иммунология животных достигла практически своего теоретического предела (радиоиммунологический метод по своей чувствительности позволяет определять Ю-9 молекул вещества в 1 мл раствора) и с помощью серологических тестов можно обнаружить единичные молекулы антигенов и антител, то в области растительной иммунологии до такого совершенства еще слишком далеко.

29

В настоящее время тесты оценки общей функциональной иммунологической системы растений слишком слабо разработаны. Однако растительная пероксидаза в качестве фермента-маркера находит все более широкое применение в иммунологических исследованиях. Так, например, методом периодатного окисления удается пометить до 99% молекул антител с максимальной плотностью 5—6 молекул пероксидазы на молекулу иммуноглобулина [Bercks et al., 1974]. Следовательно, сама молекула пероксидазы представляет собой весьма удобный для конъюгирования белок [Avrameas, 1969; Дзантиев, Егоров, 1982], имеющий в своем составе не только реакционноспособные группы, но и углеводные компоненты. Наличие функциональных групп и гликопротеидная природа позволяют этому ферменту осуществлять ковалентное связывание с различными соединениями, а в присутствии галогенов и перекиси водорода выступает как антибактерицидный комплекс, о чем речь пойдет ниже.

3.2. АНТИПАТОГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ

Симоне и Росс [Simons, Ross, 1965, 1970], обосновывая участие пероксидазы в процессах устойчивости к вирусному поражению, предположили, что фермент убивает инфицированные клетки и таким образом подавляется размножение вируса. В дальнейшем в это предположение вносились поправки, и теперь уже ясно, что образование некроза прямо не связано с действием этого фермента. Некроз образуется при активации ряда ферментов, но один из них, а именно фенилаланин-аммиак-лиаза, является непосредственным маркером некрозообразова-ния [Vegetti et al., 1975].

Прямое действие пероксидазы растений на патоген было показано для некоторых животных объектов. Так, Венере [Venere, 1980] установил, что пероксидазы из семядолей хлопчатника, устойчивого к увяданию, образуют продукт, который был бактерицидным к Xanthomonas malvacearum при условии, если в инкубационную среду добавляли кате-хин и перекись водорода. Последние соединения накапливаются в зараженных растениях. Установлено также, что сильным антимикробным действием обладали системы миелопероксидаза или лактопероксидаза-перекись водорода — галоген [Jago, Morrison, 1962; Klebanoff, 1968; Klebanoff, Hamon, 1972]. В присутствии перекиси водорода и йодида калия миелопероксидаза и пероксидаза хрена быстро убивали сходные по патогенности виды грибов и бактерий. Интересно отметить, что бактерицидное действие этой системы усиливали некоторые фенолы [Urs, Dunleavy, 1974, 1975].

Роли пероксидазы в защитном механизме клеток животных посвящено много работ. Установлено, что у больных с тяжелыми и длительными инфекциями, когда организм уже не в состоянии защищаться, резко снижается количество пероксидазоположительных гранул и после этого судьба организма практически предрешена [Роговнн и др., 1977]. Авторы пишут, что снижение и исчезновение миелопероксидазы сопровождается ослаблением антимикробной активности, а также о прямом участии пероксидазной системы в повышении защитной функции различных организмов, в том числе человека.

30

Изменение активности пероксидазы при патологиях начали детально изучать только после того, как была осознана та огромная роль перокси-дазных систем, которую они играют в метаболических процессах [К1е-banoff et al., 1966; Klebanoff, 1968]. Действие животных пероксидаз (миелопероксидаза, лактопероксидаза и др.) основано на том же принципе, что и действие растительных пероксидаз,— на окислении различных субстратов в присутствии перекиси водорода. Это обязательное условие каталитического акта пероксидаз различного происхождения и объединяет их в один тип таких ферментных белков. В организме человека и животных существует несколько пероксидаз, сходных функционально, но отличающихся друг от друга по некоторым свойствам и специфичности по отношению к субстратам [Шафран, 1981].

Для большинства пероксидаз животных устан