ратов [Brignac, Tien-hue Yu, 1975]. Так, значение /СтХЮ-5 М для я-гидроксифенилуксусной кислоты равно 500, а для л-крезола эта величина равна всего лишь 1, что свидетельствует о различном сродстве изопероксидаз к этим фенольным соединениям.

' Лобаржевский [Lobarzewski, 1981] определил Km пероксидазы хрена для 16 различных субстратов и показал различия между ними. Совместно с Трояновским он установил Кт Для распространенных субстратов с пероксидазой, выделенной из гриба (Tramotes versicolor), и выяснил, что Km грибной пероксидазы по отношению к я-фенилендиамину равняется 10,0, а для о-дианизидина — 0,006 М-1, т. е. у последнего субстрата сродство к ферменту гораздо выше [Lobarzewski, Trojanowski, 1979]. Высказано предположение, что механизм пероксидазного катализа различен в реакциях с разными субстратами. Так, феррицианид калия цступает в реакцию непосредственно с гемом, а о-дианизидин взаимодействует с функциональными карбоксильными группами белка молекулы фермента [Лебедева и др., 1981].

Интересные исследования были проведены Галстоном с сотрудниками. Они нашли, что индивидуальные изопероксидазы с различной скоростью окисляют все множество свойственных им субстратов, но ие все множество изоформ фермента присутствует в растении постоянно [Siegel, Galston, 1967 a, b]. Установлено также, что у филогенетически разных растений пероксидазы различаются по проявлению сродства к таким субстратам, как бензидин, гваякол и пирогаллол [Georgiew et al., 1977]. Субстраты с наибольшим сродством к ферменту, дающие окрашенные продукты деятельности изопероксидаз (бензидин, его производное о-дианизидин и гваякол), чаще других используются для выявления различных изоэнзимов. Перечень субстратов, указанных в цитируемых работах, дает некоторые представления о широте специфического действия пероксидазы. С этой же целью можно рекомендовать обзор, в котором рассматриваются пероксидазы растительного и животного происхождения, а также кинетика их взаимодействия с субстратами различной природы [Dunford, Stillman, 1976].

Итак, пероксидаза является гемсодержащим гликопротеидом. Каталитические свойства его строго специфичны к перекиси водорода, но этот фермент проявляет широкую специфичность к другим, весьма разнообразным по строению субстратам. Ряд исследователей считают, что пероксидаза имеет один активный центр, в состав которого входит трехвалентный атом железа, не меняющий своей валентности. Однако многофункциональность пероксидазы не исключает возможности наличия и второго каталитического участка на поверхности нативной молекулы белка.

17

ГЛАВА 2

РОЛЬ ПЕРОКСИДАЗЫ

В РАСТИТЕЛЬНОМ ОРГАНИЗМЕ

2.1. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ

О важной физиологической роли этого фермента в клетках растений писал еще Д. М. Михлин [1947]. В настоящее время установлено, что активность изопероксидаз сильно зависит от присутствия субстратов и поэтому физиологические функции отдельных изоформ фермента зна^ чительно различаются [Gibson, Liu, 1978; Mader, Amberg-Fischer, 1982]. Пероксидаза катализирует большинство реакций, протекающих во всех типах тканей. Для этого фермента многие авторы отмечают видовун^ [Ferri, Guzman, 1970; Sheen, 1970, Dumitrescu. Cartior, 1971; Cuzman et al., 1971; Папковская и др., 1974], органогенную [Klapper, Hackett,1965^ Botosaneanu, 1968], тканевую [Veech, 1969; Рубин, Будилова, 1970; Sheen, Redagay, 1970; Rucker, Radola, 1971] и внутриклеточную [Pennon et al., 1970; Будилова и др., 1971; Рубин, Ладыгина, 1974; и др.] специфичность распределения изопероксидаз.

Присутствие фермента в хлоропластах указывает на его участие в окислительно-восстановительных реакциях в процессе фотосинтеза [Воронков, Живописцева, 1970; Иванова и др., 1970; Рубин, Ладыгина, 1974], а обнаружение пероксидазы в митохондриях — на участие в энергетическом обмене клетки [Pleniscar et al., 1967; Ладыгина и др., 1970; Миронова, Сирота, 1977]. Значительная пероксидазная активность' определена в очищенных препаратах рибосом [Lanzani, Calante, 1964;, Pennon et al., 1970], и, как считают авторы, фермент прочно связан с их, структурой, являясь, видимо, составной частью этих органелл. Специфичный набор изопероксидаз присутствует в паренхимных клетках клубней картофеля, определяя дифференциацию этих клеток [Borchert, 1974]. Максимальная пероксидазная активность обнаружена в эпидермисе и сосудисто-волокнистых пучках- тканей чайного растения [Запрометов и др., 1982].

Японские исследователи [Matsushita, Ibuki, 1960] высказали предположение о существовании пероксидазной системы, связанной с метаболизмом рибонуклеопротеидов. Имеются данные об участии пероксидазы в окислительном декарбоксилировании аминокислот [Mazelis, 1962] и превращении триптофана в ИУК [Riddle, Mazelis, 1965].

На основании цитохимических исследований пероксидазная активность была обнаружена в цитоплазме, клеточной стенке, хромосомах и ядрышках. В молодых клетках кончиков лука наивысшая активность пероксидазы сосредоточена в ядрах [Ridge, Osborne, 1970; Raa, 1973]. Это свидетельствует о возможном участии пероксидазы в специфической ядерной функции, а так как часть изоэнзимов являются щелочными белками, то не исключено, что они могут выполнять функцию, подобную функции гистонов. Данные о роли пероксидазы в клетках, полученные на основе цитохимических исследований, находят все больше подтвержде-

18

ний и на биохимическом уровне. Так, Зигель и Галстон [Siegel, Galston, 1967b], изучая изопероксидазы гороха, показали увеличение числа щелочных изоэнзимов в связи с ростом и дифференциацией клеток. На этом основании ими высказано предположение, что щелочные пероксидазы могут функционировать как модификаторы генной активности.

Пероксидаза является индуцибельным ферментом, индукторами которого могут быть разнообразные физические, химические и биологические факторы, в том числе особого внимания заслуживают фитогор-моны, как регуляторы многих физиологических процессов [Кулаева, 1978; Иштирякова, 1980]. Для пероксидазы доказано ее участие в образовании ауксина и этилена, восстановлении нитратов и нитритов, т. е. в азотном обмене, ростовых и дыхательных процессах [Рубин, Ладыгина, 1974]. В присутствии пероксидазы регулируется созревание и старение тканей, а также синтез лигнина, входящего в состав клеточных стенок. Возможно, физиолого-биохимическая роль пероксидазы клеточной стенки заключается в разрушении ИУК, которая может изменять физиологическое состояние клетки [Raa, 1973].

Пероксидаза ускоряет гидроксилирование пролина, входящего в состав клеточных стенок, что влияет на их растяжимость, и в результате регулируется проницаемость клеточных мембран [Ridge, Osborne, 1970]. Выяснено также, что пероксидазы клеточных стенок растений табака катализируют NADH-зависимое образование перекиси водорода [Mader, Amberg-Fischer, 1982]. Участие пероксидазы в окислительных превращениях NADP - Нг изучали на примере пероксидазы кукурузы, используя кофакторы оксидазной функции фермента Мп2+ и 2,4-дихлор-фенол (ДХФ). При этом цианистый калий, ингибируя пероксидазу, уменьшал влияние Мп2+ и ДХФ на окисление NADP -Нг [Рубин и др., 1968].

Большую работу, освещающую различные стороны физиологических и биохимических свойств изопероксидаз растений табака, их сродство к субстратам, провели Мэдер с сотр. [Mader, 1976, 1980; Mader et al., 1975, 1977, 1980]. Они разделили выделенный препарат фермента на четыре группы и охарактеризовали по подвижности в электрическом поле, по локализации в определенных компартментах клетки, по отношению к фенольным соединениям. Установлено, что в составе клеточных стенок присутствуют как анодные, так и катодные формы фермента. В цитоплазме в основном выявлены катодные пероксидазы. Так, пероксидаза Г1 не связана с клеточной стенкой, а ГП и ГШ обнаружены как ионосвязанными, так и ковалентносвязанными со стенкой клетки [Mader, 1976]. Изопероксидазы группы П обладают наибольшим сродством к искусственным субстратам, а группы ГШ — к естественным. Высокое сродство к искусственным субстратам может служить основой для предположения о том, что эти пероксидазы выполняют защитную функцию, освобождая клетки от чужеродного материала. При этом большое количество изоэнзимов пероксидазы позволяет окислять самые разнообразные вещества, увеличивая физиологическую значимость этого фермента. В опытах с каллюсной тканью табака было показано, что пероксидазы в ней менее гетерогенны, но активность таких изопероксидаз

19

гораздо выше, чем в дифференцированных тканях. Преобладают в кал-люсе кислые формы фермента с изоэлектрическими точками в области рН 4,0—4,5 [Nessel, Mader, 1977].

Имеющиеся экспериментальные данные говорят в пользу того, что пероксидаза связана с целым рядом метаболических превращений, происходящих в клетках, обладая широким спектром действия фермента, в пределах рН от 3 до 14. Пероксидаза активизируется при очень многих изменениях и нарушениях метаболизма растений, а некоторые изоэнзимы в ответ на стресс синтезируются de novo. Однако до сих пор нет достаточно полного объяснения механизма регуляции синтеза изоэнзимов и проявления их свойств при стрессовых и патологических воздействиях. Несмотря на большой поток информации по изучаемому ферменту, физиологическая функция пероксидазы до конца не понята, и сложность ее изучения состоит в том, что действие фермента в нативной клетке невозможно со всей полнотой моделировать in vitro. Очевидно, именнЬ этим объясняется то, что до настоящего времени нет единой теории о связи всех многообразных реакций, в которых участвует пероксидаза.

2.2. УЧАСТИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В ДЫХАНИИ РАСТЕНИЙ

Все гетеротрофные организмы получают энергию в результате окислительно-восстановительных реакций, в которых электроны переносятся от доноров-восстановителей к акцепторам-окислителям. Каждый этап дыхания осуществляется при участии нескольких ферментов, связанных близостью функции. С эволюционной точки зрения целесообразность присутствия в клетке системы ферментов, выполняющих одну и ту же или сходную химическую реакцию, обеспечивает надежность прохождения дыхательного пут