иси, в том числе и перекиси ненасыщенных жирных кислот и каротина. К субстратам, окисляемым пероксидазой в присутствии перекиси, можно отнести большинство фенолов (пирокатехин, пирогаллол, гидрохинон, резорцин, гваякол), а также бензидин, адреналин, анилин, к-толуидин, ароматические кислоты (бензойную, салициловую, галловую), аскорбиновую кислоту, нитриты и ряд других соединений.

Установлено, что фермент обладает не только пероксидазными, но и оксидазными свойствами, катализируя окисление целого ряда соединений за счет неактивированного молекулярного кислорода. Наличие у пероксидазы двух различных функций уже не вызывает сомнений, однако нет однозначного ответа на вопрос о том, один или два активных центра присутствуют в молекуле пероксидазы. Это объясняется недостаточным

13

количеством данных о деталях структуры фермента и его молекулярной неоднородностью.

Приоритет в открытии оксидазной функции принадлежит Теореллю [Swedin, Theorell, 1940]. В некоторых растениях он обнаружил фермент, окисляющий дигидроксифумаровую кислоту (ДГФ) с поглощением кислорода, и доказал, что этот фермент — пероксидаза. Оксидазная функция фермента проявляется во взаимодействии с соединениями различной химической природы: флороглюцином, дигидроксифумаратом, индолилацетатом, гидро-и нафтогидрохинонами, глютатионом и рядом других веществ [Иванова, Рубин, 1962, 1963; Рубин, 1966; Klapper, Нас-kett, 1963; Yamazaki, Piette, 1963; Kay et al., 1967]. Необходимым условием оксидазной реакции является наличие кофакторов-ионов марганца и различных фенольных соединений.

Пероксидазная и оксидазная активность была проверена с перокси-дазой, выделенной из земляного ореха [Chibbar, Huystee, 1984]. Исследователи установили, что удаление гема практически не меняет размера молекулы, но приводит к полной потере пероксидазной активности. При этом оксидазная активность фермента снизилась только на 20%. После реконструирования (объединение гема с апоферментом) активность составляла лишь 50% активности нативного энзима. Субстратами для проявления оксидазной функции пероксидазы могут быть гидро-, нафто-хиноны, индолилуксусная кислота, восстановленные коэнзимы NAD-•Н2 и NADP-H2 [Klapper, Hackett, 1965; Srivastava, Huystee, 1977а]. Проводились также исследования по изучению условий окисления NAD и NAD-H пероксидазами, выделенными из растений хрена [Avigliano et al., 1985].

Особый интерес представляет способность пероксидазы окислять предварительно окисленным триметафенол-флороглюцином [Yamazaki, Piette, 1963; Рубин, Логинова, 1973; Иванова и др., 1966, 1970] такие биологически важные соединения, как NAD-H2 и NADP- Н2. Это свойство фермента свидетельствует о принципиальной возможности участия пероксидазы в нормальном дыхании клетки путем активации кислорода воздуха для окисления обычных субстратов дыхания — метаболитов цикла Кребса [Воронков, 1967; Kay et al., 1967].

В работе Шэннона с соавт. [Shannon et al., 1966] имеются данные о каталитических свойствах семи изоэнзимов пероксидазы из корней хрена. При использовании в качестве субстрата о-дианизидина (пероксидазная функция) установлено, что более активны были анодные изоэнзимы, тогда как при проверке со щавелевой кислотой (оксидазная функция) более высокую активность проявляли катодные изоэнзимы. Т. М. Иванова, Б. А. Рубин [1962] провели сравнительное изучение двух препаратов фермента, применив в качестве субстрата флороглюцин. Оказалось, что оксидазная активность пероксидазы пропорциональна ее пероксидазной активности. Исходя из полученных результатов, авторы высказали предположение, что активный центр фермента, ответственный за окисление как неактивированным (молекулярным), так и активированным (пере-кисным) кислородом, один и тот же. К такому же выводу пришли и другие исследователи [Попов, 1965; Walker, Kilgour, 1965; Иванова и др., 1967; Harada, Wada, 1968; Пейве и др., 1972].

14

Однако в других работах приводятся данные о существовании двух различных центров ферментативной активности пероксидазы [Siegel, fcalston, 1967а, b; Рамазанова и др., 1971]. Интересные результаты по этому вопросу получены при окислении пероксидазой индолилуксусной йислоты [Siegel, Galston, 1967а; Alghisi et al., 1971]. Апофермент пероксидазы хрена после удаления геминовой группы был лишен перокси-дазной активности (субстраты — пирогаллол, бензидин, гваякол), но ^охранял оксидазную активность в присутствии индолилуксусной кислоты (ИУК). После рекомбинации апофермента с гемом восстанавливалась только 1/40 пероксидазной активности, тогда как оксидазную активность фермент сохранял полностью. Поскольку рекомбинация апофермента с гемом не изменяет оксидазной активности пероксидазы, указанные авторы Ьысказали предположение о существовании двух различных активных ¦ентров фермента.

Л. X. Рамазанова с соавт. [1971] исследовали влияние некоторых ингибиторов на гемин и белковую часть фермента пероксидазы и показали ¦то цианид и кипячение больше ингибировали пероксидазную активность, р азид и диметилформальдегид — флороглюциноксидазную. Эти исследователи допускают присутствие в молекуле фермента наряду с пероксидаз-иым и оксидазного активного центра. Очевидно, пока нет оснований полностью отрицать предположение указанных авторов. | О механизме проявления ИУК-оксидазной активности и о роли в этом Процессе карбоксильных и аминогрупп пероксидазы, выделенной из трех различных объектов, пишут польские исследователи [Lobarzewski, Volski, 1985]. Оказалось, что если «пришивка» фермента к матриксу осуществлялась по свободным аминогруппам, то ИУК-оксидазная активность у пероксидазы отсутствовала. Иммобилизация фермента через карбоксильные группы приводила к полному восстановлению этой активности. Поскольку в обоих случаях с матриксом связывали одинаковое количество пероксидазы, то потеря пероксидазой ИУК-оксидазной активности означала, что для протекания реакции окисления ИУК в активном центре пероксидазы необходимо присутствие свободных карбоксильных групп, которые in vivo могут связываться с аминными группами белка фермента.

Показана роль пероксидазы в проявлении оксигеназной функции, свойственной рибулозодифосфаткарбоксилазе / оксигеназе у высших растений [Demirevska-Kepova, Vassileva, 1985]. Пероксидазы из корней ячменя и ложницы, кроме пероксидазных и оксидазных свойств, выражали и оксигеназные, но для реакции был необходим ион меди. Для проявления каталитической активности пероксидазы в некоторых реакциях совершенно необходимы кофакторы. В роли кофакторов для этого фермента могут быть ионы таких металлов, как Mn2+, Zn2+, Cu2+, Са2+ и др., или сложные органические соединения, вступающие во временное взаимодействие с молекулой пероксидазы.

Изложенное выше свидетельствует о том, что пероксидаза, проявляя различную ферментативную активность, может быть отнесена к числу регуляторных ферментов. К тому же она способна изменять активность путем ковалентной или ионной модификации своих специфических функциональных групп, необходимых для более полного выражения каталитической эффективности фермента. К их числу относятся три карбоксиль-

15

ные группы нативного белка пероксидазы, которые участвуют в окислении о-дианизидина [Ugarova et al., 1984]. Н. Н. Угарова и О. В. Лебедева [1978] пишут, что динамическая структура активного центра фермента, полуфункциональность групп активного центра, высокие потенциальные возможности реализации нескольких путей электронного транспорта в пероксидазе являются теми основными факторами, которые, по-видимому, и обеспечивают эффективное выполнение ею физиологических функций. Регулирование пероксидазной активности с помощью рН, ингибиторов и активаторов позволяет как бы сузить субстратную специфичность фермента, сделать более эффективным одно необходимое! превращение из большого числа возможных реакций.

1.5. СРОДСТВО К СУБСТРАТАМ

Весьма широкая специфичность пероксидазы к субстратам различной природы вызывает самый пристальный интерес. В настоящее время почти отсутствуют исследования, в которых приводился бы достаточно полный анализ избирательности изоэнзимов этого фермента по отношению к стереохимическому расположению окисляемых субстратов.' В реакциях взаимодействия фермента и субстрата молекула субстрата должна иметь две структурные особенности: 1) специфическую химическую связь, которую фермент мог бы атаковать; 2) функциональную группу, ориентирующую молекулу субстрата в активном центре так, чтобы атакуемая связь субстрата была правильно-расположена по отно! шению к каталитическому центру фермента. Так, для многих ферментов лимитирующей стадией реакции является изменение конформации белка,' индуцируемое субстратом, коферментом или эффектором [Гольдштейн и др., 1974].

Скорость образования соединений фермент—субстрат очень велика, и активность фермента лимитируется скоростью распада этого комплекса — константой Михаэлиса—Ментен Кт- Однако величина Кт может меняться в зависимости от того, какой изоэнзим катализирует данную реакцию. Так, Гибсон и Ли проверили два выделенных изоэнзима пероксидазы проростков гороха с искусственными (о-дианизидин и бензидин) и естественными (эугенол, кофейная и феруловая кислоты) субстратами и показали, что величина Km различается для изоэнзимов этой пероксидазы в зависимости от использования того или иного субстрата. Исследуя изоэнзимный состав пероксидазы в динамике развития проростков гороха с этим пятью субстратами, они установили, что в опытах с кофейной кислотой наибольший пик активности наблюдается на 7-й день после проращивания семян. Методом электрофореза был выявлен изофермент, ответственный за эту реакцию, и выяснено, что он не реагировал с другими субстратами [Gibson, Liu, 1978].

Величина Кт зависит от типа субстрата, рН реакционной смеси и температуры. Если фермент катализирует превращения нескольких близких субстратов, то каждому субстрату соответствует собственная величина Km- В первом приближении реакция катализа протекает тем быстрее, чем ниже Km- Величина Кт суммарной пероксидазы хрена была

16

дана для сравнительно большого количества субст