ма при этом меняется от коричневого до красного.

Эти сведения интересны в том плане, что гемин входит в состав многих* весьма важных биологических молекул, образуя связь с различными? по строению белками. Известно также, что гемин стабилизирует белковук* глобулу гемсодержащих ферментов, и не только пероксидазы, но и ка^ талазы, цитохрома Р-450, гемоглобина, миоглобина. Для пероксидазы! хрена с молекулярной массой 44 кДа гематин составляет 1,48% этог^| веса. Лобаржевский [Lobarzewski, 1977] определил процентное содерт1 жание гематина для двух грибных (Juonotus radiatus) пероксидаз,' соответственно для пероксидазы 1а —1,09% и пероксидазы Па—1,15%. Свободный гем (не связанный с белком) обладает рядом свойств, присущих гемсодержащим белкам: способностью к комплексообразованию с различными лигандами, к реакциям электронного переноса, к катализу окислительно-восстановительных реакций.

Связь гема с белковой частью молекулы пероксидазы хрена и кинетика этого взаимодействия подробно изучены в работах, проводимых на кафедре химической энзимологии МГУ [Березин и др., 1974, 1975а, б; Угарова и др., 1977; Угарова, Лебедева, 1978; Ugarova et al., 1984]. Авторы показали, что комплексообразование апопероксидазы с гемином и протопорфирином заметно изменяет третичную структуру белка, что проявляется, в частности, и в наблюдаемых различиях рК ионогенных групп, ответственных за поддержание стабильной конформации белковой глобулы пероксидазы хрена. Некоторые различия в третичной структуре белка вокруг гема были показаны для кислых и основных пероксидаз хрена и редьки. Методом кругового дихроизма исследованы конформа-ционные различия между пероксидазами хрена и репы, и высказано предположение, что активные участки их подобны по строению, а сами пероксидазы различаются по аминокислотному и карбогидратному составу [Gaspar et al., 1982].

1.3. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА

Первичную структуру пероксидазы хрена стали изучать сравнительно давно [Paul et al., 1953; Shannon et al., 1966; Paul, Stigbrand, 1970]. Шэннон с соавт. разделили пероксидазу из корней хрена на пять отдельных фракций: Ai, Аг, Аз, В и С. Выделенные фракции были гидролизованы и разделены хроматографически на индивидуальные аминокислоты.

10

Авторы установили, что белковая часть этих пероксидаз состоит из 18 аминокислот. Пероксидазы Ai, А2, A3 имеют в своем составе оксипролин, а фракции В и С оксипролин не содержат. Возможности методов тех лет ие позволили провести более тщательную очистку и разделение, но, несмотря на это, полученные данные вызывали несомненный интерес, так как давали представление о существенных различиях между перок-сидазами одного и того же исходного материала. Авторы показали, что А-пероксидазы содержат значительно больше ароматических аминокислот, чем пероксидазы В и С. Различаются они также и по некоторым физико-химическим свойствам. Все изопероксидазы растений хрена имеют одну полипептидную цепь, но отличаются по первичной структуре белковой молекулы [Shin et al., 1971]. Авторы установили, что изопероксидазы хрена имеют по шесть полуцистеиновых остатков в каждом изо-энзиме, которые составляют по три дисульфидные связи, и что в нативной пероксидазе нет свободных SH-rpynn.

Изучение первичной структуры пероксидазы хрена провели также Белиндер и сотр. [Welinder et al., 1972]. Они выяснили, что в состав первичной структуры белка может входить от 203 до 300 аминокислотных Остатков. Ими же определены N- и С-концевые аминокислоты для исследуемых пероксидаз.

В 1981 г. вышла работа японских исследователей, которые выделили, очистили и закристаллизовали шесть щелочных изоэнзимов пероксидазы хрена [Aibara et al., 1981]. По количеству аминокислотных остатков {от 296 до 318) и соотношению углеводных компонентов все шесть изоэн-зимов заметно различались между собой. Было установлено, что из шести изопероксидаз четыре (Ез—Ее) имели экстремально высокие значения рН изоэлектрической точки (выше 12) и сравнительно низкое содержание углеводов — всего от 0,8 до 4,2%. Изоэнзимы Ei и Ег содержали 12,0 и 14,1% углеводов и имели изоэлектрическую точку— 10,6.

В составе углеводной части молекулы пероксидазы хрена идентифицированы нейтральные и аминосахара в количестве до 20 % общего веса [Shannon et al., 1966]. Среди них идентифицированы галактоза, глюкоза, манноза, арабиноза, ксилоза, фруктоза и гексозамин [Klapper, Hackett, 1965]. Установлено, что молекулы Сахаров могут присоединяться только к пяти аминокислотным остаткам из тех двадцати, которые входят в состав полипептидной цепи [Sharon, 1974]. Для многих гликопротеинов показано, что первое звено полисахарида (ацетилгалактозамин) присоединяется к аспарагину.

Различия в первичной структуре по качественному и количественному составу аминокислот и Сахаров были найдены для пероксидаз самых различных растений [Mazza et al., 1973; Tyson et al., 1978; Mader, 1980; Kim et al., 1980; Vandenberg, Vanhuystee, 1984; Floris et al., 1984]. Следует отметить, что среди изоэнзимов пероксидазы есть и такие, которые не содержат углеводных компонентов. Так, из культуры ткани табака W-38 и суспендиальной культуры табака WR-132 были выделены две анодные (Ai и А2) и две катодные (Сз и С4) изопероксидазы, и оказалось, что изоэнзим С4 содержал углеводные остатки [Powell et al., 1975].

Роль углеводных компонентов в молекуле пероксидазы пока до конца

11

не выяснена, так как отщепление некоторых углеводов не приводило к изменению ферментативной активности. Так, удаление глюкозы или галактозы из молекулы пероксидазы не снижало активности, но повышало устойчивость к протеолитическим ферментам [Tadors et al., 1982, 1983]. Авторы предполагают, что углеводы облегчают прохождение пероксидазы через мембрану и стабилизируют трехмерную структуру апофермента. Как показали Н. Н. Угарова и др. [Ugarova et al., 1984], конформационная упаковка пероксидазы хрена такова, что только немногие участки функциональных групп белковой части располагаются близко к поверхности молекулы и доступны для модификации. Большинство же этих групп так или иначе удалены от края, защищены карбо-гидратными остатками и, следовательно, недоступны. Такая структурная организация пероксидазы, очевидно, и обусловливает определенные особенности каталитического акта.

1.4. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Основная функция пероксидазы — катализировать окисление химических соединений за счет кислорода перекиси с образованием промежуточных комплексов, обладающих различными спектральными характеристиками. К настоящему времени обнаружено четыре типа комплексов. Комплекс I образуется сразу при добавлении Н2Ог и обычно быстро превращается в комплекс II; комплексы III и IV представляют собой соединения, появляющиеся при избытке перекиси. Комплексы III и IV не обладают каталитической активностью, их образование ведет к торможению реакции.

Классическими работами по изучению этого вопроса являются работы Теорелля и Чанса [Theorell, 1942; Chance, 1949, 1954],'которые показали существование промежуточных соединений фермента с субстратом. Спектрофотометрически Чансу удалось различить четыре промежуточных соединения фермента с субстратом, из которых хорошо изучены только два (I и II). Превращение комплекса I в комплекс II протекает быстрее в присутствии донора водорода, например полифенолов. Общая схема действия пероксидазы была предложена Чансом:

*i

Е + S, « *" ?¦, + Н20 О)

Е, + S2-*- Е2 + Р (2)

к3

Ег + S2-*- Е + Р (3)

2Р -*~ Р (4)

Здесь Е — нативный фермент, Е\ и ?2 — промежуточное соединение I и II, Si и S2 — перекись водорода и донор водорода соответственно, k — константа скорости реакции, Р — продукт реакции. Реакции {2) и (3) являются процессами одноэлектронного восстановления промежу-

12

точных окисленных форм Е\ и Еч\ Е\ обладает двумя дополнительными окислительными эквивалентами по сравнению с нативным ферментом, a Ei — одним [Угарова, Лебедева, 1978]. , Согласно исследованиям Фромма [Fromm, 1967], механизм действия пероксидазы напоминает реакции для трех субстратов по типу «пинг-ронг», где фенолы — два независимых субстрата, а перекись водорода является третьим субстратом. В результате такого типа реакций образуется свободные радикалы. Феноксильные радикалы могут появляться на двух отдельных стадиях катализа [Wilson, Wong, 1976] и объединяться в димеры. Как указывают Диннер и др. [Danner et al., 1973], радикалы не могут находиться в растворе в свободном состоянии, так как тогда $ы они давали такие смеси продуктов, как, например, о-о-дифенол, я-п-дифенол и о-л-дифенол. Но в этих случаях присутствует только один продукт ферментативной реакции, а именно о-о-дифенол, и это свидетельствует о том, что радикалы соединяются с белком пероксидазы. Полученные данные подтверждают мнение, что каталитический акт происходит и на поверхности белка, причем фенолы усиливают эффект модификации молекулы фермента [Fox, Purves, 1968; Ugarova et al., 4984].

Чане и Фредович высказали предположение, что субстраты пероксидазы можно разделить на два группы. Субстраты первой группы (к ним относятся в основном неорганические ионы — ферроцианид, йодид, нитрит и т. д.) взаимодействуют непосредственно с гемом. Субстраты второй группы (ароматические амины и фенолы) непосредственно с гемом не реагируют. Следовательно, должна существовать некая электрон-транспортная цепь, включающая функциональные группы белковой части молекулы. Различия между субстратами проявляются в разной зависимости от рН при взаимодействии с промежуточными соединениями Е\ и Ei и в чувствительности субстратов к действию активаторов [Лебедева и др., 1977; Kabayashi et al., 1986]. Геометрию комплексов пероксидазы хрена с ароматическими субстратами дают в своей статье А. М. Качурин и В. Н. Фомичев [1982].

Присутствующий в пероксидазе единственный ион железа обладает способностью не только активировать перекись водорода, ио и сообщать ей способность вступать в реакции окисления различных субстратов. Источником активного кислорода при каталитическом действии пероксидазы могут служить также и органические перек