троля. Она остается высокой в молодых, отрастающих листьях и после того, как опадут зараженные нижние листья. Присутствие и активность фермента контролируются концентрацией конечного продукта. Увеличение продукта снижает синтез фермента, и наоборот. В основе такого механизма лежит принцип экономии, т. е. выбор наиболее выгодного пути использования материала и энергии. Организм, поддерживающий активность определенных изоэнзимов, должен либо синтезировать добавочное количество необходимых изоэнзимов, либо максимально активизировать их деятельность.

Каталитическая функция выделенных нами анионных пероксидаз не связана с увеличением количества ферментного белка, за счет которого шло бы повышение активности. Отсутствует также и синтез этих пероксидаз de novo, так как изоэнзимы с такой же изоэлектрической точкой присутствуют в достаточном количестве в контрольных листьях здоровых растений. К тому же количественные соотношения присутствующего

90

в клетке ферментного белка не могут изменяться в широких пределах. Для этого необходима экспрессия соответствующего гена или нескольких генов. Это и понятно, так как сам по себе синтез любого белка весьма энергоемкий процесс, требующий строгого контроля со стороны деятельности генома клетки. Поэтому в живом организме большую роль играют микроокружения как молекулы фермента в целом, так и его активного центра. Изменение микроокружения — более выгодный путь в любой стрессовой ситуации, и лишь только затем растение может мобилизовать свои ресурсы на синтез необходимого в данный момент белка.

Наши данные свидетельствуют о том, что не синтез определяет повышение активности исследуемых изопероксидаз. Соотношение углеводной, белковой и небелковой частей молекул анионных пероксидаз различается в опыте и контроле (табл. 21). В данном случае может происходить как изменение микроокружения активного центра, так и изменение конфигурации молекул за счет отщепления каких-то составляющих, что и обеспечивает значительное повышение активности этих изопероксидаз. Известно, что специфичность по отношению к субстратам определяется белковой компонентой фермента. Данные таблицы дают основание сделать вывод о значительной перестройке молекул анионных пероксидаз, так как на единицу веса содержание белка в препаратах инфицированных растений в 2,5 раза ниже, чем в контроле. Значительно снижено в их составе и содержание Сахаров. Таким образом, изменения в составе молекул анионных изоэнзимов могут быть определяющими для проявления максимального каталического акта в тканях с вирусиндуцированной системной устойчивостью.

ГЛАВА 7

УЧАСТВУЕТ ЛИ ПЕРОКСИДАЗА В ЗАЩИТНОМ МЕХАНИЗМЕ?

Важной проблемой современной биологии является индуцирование механизмов противовирусного иммунитета растений, направленных на снижение повреждающего действия патогена. Именно ограничение репродуктивной активности возбудителя и есть результат действия защитных механизмов. Развитие и исход инфекционного процесса зависят от трех основных факторов: физиолого-биохимического состояния макроорганизма, активности его защитных реакций, особенностей размножения патогена и особенностей проявления «антагонистических взаимоотношений» между вирусом и растением-хозяином. Вирус, попадая в клетки растений, индуцирует появление так называемых «патогенезозависимых» белков, тесно связанных с устойчивостью [Harrison, 1982]. За последние 15 лет исследования многих авторов так или иначе были посвящены изучению синтеза и роли этих белков в метаболизме вирозных растений [Gianinazzi et al., 1970; Loon, Kammen, 1970; Kassanis et al., 1974; Gianinazzi, Martin, 1975; Loon, 1975, 1976a; Antoniw et al., 1980; Kassanis, 1981; Jamet et al., 1985].

91

Среди естественных ингибиторов, подавляющих репродукцию вирусов на раннем этапе патогенеза, все чаще называют интерфероноподобные белки растений [Antoniw et al., 1980; Kassanis, 1981; Loon, 1982]. В отличие от истинных интерферонов [Baglioni, 1979] у растений интерфероноподобные белки присутствуют более длительное время, но пока неизвестно, каким образом включается этот защитный механизм и как он осуществляется на молекулярном уровне. Один из таких белков обладает очень сильным антивирусным действием [Sela, 1981], имеет гли-копротеидную природу и каким-то образом связан с функцией гена N. В связи с этим важен тот факт, что пероксидаза также является белком гликопротеидной природы, а углеводный компонент, как известно, регулирует специфичность белковой части молекулы [Туманова, 1978].

Роли фермента пероксидазы в метаболизме больного растения посвящено большое количество работ (см. обзоры: [Омельченко, Андреева, 1976; Gaspar et al., 1982] и др.), однако ее участие в защитных реакциях пораженных растений продолжает привлекать внимание многих исследователей, так как повышение активности этого фермента коррелирует с устойчивостью, запрограммированной самим организмом. Становится очевидным, что пероксидаза катализирует такой тип реакций, который является основным в окислительно-восстановительных процессах зараженных организмов, и этим обусловлено повышение ее активности.

Метаболизм пероксидазы и фенольных соединений тесно взаимосвязан, и, следовательно, повышение активности фермента в листьях, обладающих вирусиндуцированной устойчивостью, должно отражать изменения в содержании субстратов — соединений фенольной природы. Наиболее детально изучены состав ферментов и образование фенолов в местах локализации вирусных частиц, в области некрозов сверхчувствительных растений-хозяев. Так, в 70—80-е годы особенно интенсивно исследовалось участие трех ферментов в формировании местных поражений: пероксидазы, полифенолоксидазы и фенилаланин-аммиак-лиазы. В зоне образования некрозов (см. 4.2) аккумулируются фенольные соединения, которые окисляются до токсичных хинонов. Высказывалось предположение, что сами хиноны служат медиаторами для активирования пероксидазы и полифенолоксидазы.

Однако, несмотря на сравнительно большое количество работ, посвященных этим вопросам, до сих пор нельзя со всей определенностью сказать, что является причиной, а что следствием процесса некрозообразова-ния. Пока ясно, что как при образовании самого некроза, так и на значительном расстоянии от него повышается активность фермента пероксидазы и это увеличение активности идет параллельно с формированием приобретенной устойчивости [Vegetti et al., 1975]. Чтобы понять, какой из трех ферментов играет наиболее важную роль в некрозогенезе, эти исследователи провели опыты с бобовыми растениями, инфицируя их вирусом мозаики люцерны. Авторы пришли к выводу, что, вероятно, пероксидаза в клетках устойчивых растений играет гораздо большую роль, а не только участвует в локализации вирусной инфекции. Активизация полифенолоксидазы в местах образования некрозов является вторичным эффектом, так как нет прямой зависимости между образованием некрозов и повышением активности этого фермента.

92

Было показано, что при проявлении вирусиндуцированной системной устойчивости в неинокулированных устойчивых листьях не отмечено повышение активности фенилаланин-аммиак-лиазы и полифенолоксидазы [Loon, Geelen, 1971; Fritig et al., 1973]. Установлено также, что механическое повреждение, вызванное натиранием листовой поверхности карборундом, не вызывает системной устойчивости и что системная устойчивость индуцируется только вирусной инфекцией [Conti et al., 1978]. Как считает Балл [Bell, 1981], как при образовании некрозов, так и при проявлении вирусиндуцированной устойчивости указанные выше ферменты выполняют определенную функцию.

Изменения в содержании фенольных соединений авторы часто связывают с процессом лигнификации, объясняя этим защиту растений от проникновения и распространения патогенов. Большинство работ посвящено изучению механизма активной защиты растений при поражении их грибными заболеваниями [Метлицкий и др., 1972; Богдан, 1981; Метлиц-кий, Озерецковская, 1981; Дьяков, 1983; Sohi, Raval, 1983; Harms, Ter-bea, 1984; Malmberg, Theander, 1984 и др.]. Причем роль лигнификации при взаимодействии растение—гриб действительно велика [Vance et al., 1980]. Но при вирусном поражении образование лигнина в местах формирования некрозов не определяет проявления системной устойчивости в молодых, растущих листьях, в которых участвует пероксидаза.

Конти и др. [Conti et al., 1982] нашли, что у растений Nicofiana glutinosa, инфицированных ВТМ, после появления некрозов активируются две изопероксидазы с Rm 0,47 и 0,14. При этом активирование изоэнзима с подвижностью 0,14 прямо коррелировало с суровостью некротического поражения. Ранее американские ученые идентифицировали катодный изоэнзим пероксидазы — Сг, который был ответствен за образование некроза [Sheen, Diachun, 1978а]. При скрещивании этот изоэнзим был передан потомству, которое при заражении вирусом приобретало реакцию сверхчувствительности. Убедительно показано, что изопероксидазы с подвижностью 0,14 и 0,23 активизируются в устойчивых тканях после инокуляции и параллельно с развитием системной устойчивости [Conti et al., 1982]. Авторы полагают, что пероксидаза непосредственно не включается в защитный механизм, но может играть важную роль в биохимических процессах, ведущих к формированию индуцирующего фактора, который вызывает механизм устойчивости.

Как показали наши исследования, функционально активное состояние пероксидазы может продолжаться до 30—40-го дня после заражения. Это свидетельствует о продолжительной напряженности метаболических процессов в клетках инфицированного растения. В таком случае не является ли повышение активности пероксидазы и проявление приобретенной устойчивости своего рода выражением «иммунологической памяти»? В животной иммунологии сравнительно давно появилось выражение «иммунологическая память», означающее настороженность организма к антигенам, ранее попадавшим в клетки. У животного первая встреча, например, с вирусом может дать очень сильный иммунологический эффект, такой, что организм всю жизнь «на всякий случай» будет вырабатывать антитела к этому антигену. И такой ответ хозяина в ра