зы — ман-нозу, глюкозу и галактозу; кетогексозу — фруктозу. Следовательно, выделенные изоэнзимы являются истинными гликопротеидными белками, в состав которых обязательно входят углеводные компоненты. Качественный состав моносахаров был идентичен для «вирозных» и контрольных изопероксидаз.

Необходимо отметить, что широко распространенные в природе и присутствующие в молекулах изоэнзимов пероксидазы хрена такие аминосахара, как глюкозамин и галактозамин, а также галактуроновая кислота не были обнаружены в составе углеводной части анионных изопероксидаз, выделенных как нз вирозных, так и из контрольных растений табака сорта Ксанти нк. Количественное содержание каждого из Сахаров углеводной части этих пероксидаз пока не определено, но было высчитано отношение суммы углеводов к белковому компоненту и к другим показателям молекулы пероксидазы. Оказалось, что у сравниваемых гликопротеидов это отношение составляет 2,43 для пероксидаз, выделенных из зараженных растений, и 3,15 для контрольных (табл. 21).

Таким образом, в составе контрольных пероксидаз углеводов содержалось почти в 2 раза больше, чем в изоэнзимах вирозных растений. В обратной корреляции с сахарами находится содержание неорганических компонентов. Эти показатели подтверждают необходимость детального сравнительного изучения состава молекул пероксидаз вирозных и контрольных растений. Анализ органической и неорганической части пероксидаз свидетельствует о том, что препарат из вирозных растений содержит меньше органических, но в 2 раза больше зольных элементов. Также установлено, что на 78,18% органических соединений в составе пероксидаз вирозных растений 51% составляют неизвестные органические компоненты. Если пероксидазы вирозных растений в своем составе имеют какие-то органические соединения и ясно, что это не сахара, то выяснение их природы и состава представляет определенный научный интерес.

86

Таблица 21

Содержание белка, Сахаров, органических и неорганических соединений (в %) в составе анионных изопероксидаз

Белок (1) Моно- Отноше- Неизвестные органические Всего Растения сахара (2) ние (1/2) органических неорганических

Инфицированные ВТМ Здоровые (контроль) 19,23 48,39 7,9 15,36 2,43 3,15 51,05 24,69 78,18 89,44 21,82 11,56

Можно предполагать, что такими соединениями могут быть фенолы, которые образуют с молекулой пероксидазы комплексы и при этом активируют каталитическую деятельность фермента. Данные табл. 21 могут косвенно свидетельствовать о перестройке «лабильных» участков молекул фермента под влиянием вирусной инфекции.

Гем-протеиновая связь зарегистрирована с помощью метода Маэли [Maehly, 1952]. Разрыв связи осуществлялся при смешивании в делительной воронке равных объемов метил-этил-кетона и раствора препарата анионных пероксидаз при подкислении смеси 0,1 М НС1 до кислой реакции —рН от 2,0 до 1,5. В этих условиях опыта начинается быстрое отщепление апофермента от протогемйна. Потерю ферментативной активности проверяли, определяя активность фермента до и после опыта по реакции с одним из субстратов — бензидином. После разрыва указанной связи в кислой среде пероксидазная функция фермента полностью утрачивалась. Таким образом, было получено доказательство наличия гем-протеиновой связи у исследуемых анионных изоэнзимов фермента. Потеря активности установлена как для опытных, так и контрольных пероксидаз, следовательно, мы имели дело с истинными пероксидазами, содержащими в составе молекулы геминовую группировку (см. 1.2).

Определение молекулярной массы проводили методом диск-электрофореза на основании относительной подвижности белков в зависимости от концентрации полиакриламидного геля [Hedrick, Smith, 1968]. Согласно расчетам по таблице, предложенной Г. А. Бузун [1976], масса исследуемых анионных изопероксидаз была одинаковой для «вирозных» и контрольных изоэнзимов, так как тангенс угла наклона линии регрессии был совершенно одинаков как в опыте, так и в контроле (рис. 20). На рисунке представлена зависимость относительной подвижности анионных изопероксидаз от концентрации акриламида в гелях. Проведенный расчет показывает, что их молекулярная масса равна 45—46 кДа.

Инфракрасные спектры. Метод инфракрасной спектроскопии (ИКС) является весьма эффективным для изучения особенностей биологических объектов, так как ИКС препаратов дает общий вид спектров поглощения для химических структур [Андреева и др., 1985]. Для биохимических исследований часто применяют спектроскопию пропускания с использованием прессованных таблеток с КВг для выявления в полипептидной цепи постоянных и вариабельных участков белковой

87

200

/80

/00

200

% /80

/00

^1 ~ о a

о • 1 1

/ .__д'

^^^^ П

в 1 1 в' ^ ¦ ' i

0,0 12 9,V 9,0 9,0

Рис. 20. Зависимость относительной подвижности анионных изоэнзимов (ИЭТ=3,6 и 3,8) от концентрации полиакриламидного геля: АВ/ВС=А'В'/ В'С'=6,1

а — инфицированные; б— здоровые (контроль) растения табака сорта Ксаити нк

молекулы [Смит, 1982]. Спектры почти всех белков в области длин волн 500—4000 см-1 обусловлены колебаниями пептидных групп и имеют несколько характерных полос поглощения.

Нами использован метод таблетирования исследуемых образцов с КВг и последующей регистрации спектров поглощения в широком диапазоне длин волн с записью в двух режимах на инфракрасном спектрофотометре UR-10 (ГДР). Так как фермент пероксидаза является белком гликопротеидной природы, то запись спектров проведена в пределах 400—4000 см 1 при щелевой программе 4. Скорость регистрации спектров поглощения 50 см~"'-мин —1 [Ладыгина, 1975]. Сравнительный анализ полос поглощения анионными пероксидазами инфицированных и здоровых растений показал, что их спектры различаются. Так, в области Амид IV наблюдаются существенные изменения полосы поглощения при 550 см-1 (рис. 21). Значительные изменения спектра заметны в области «углеводной» полосы поглощения при 900—1170 см-1. Такой результат подтверждает приведенные выше данные об изменениях количественных соотношений углеводного состава исследуемых пероксидаз.

Отмечены изменения полос поглощения для Амидов III, II и I. Так, для исследуемых изопероксидаз обнаружены некоторые смещения полос поглощения при 1250 см-1 и дальше к области Амид II. Изменение полос поглощения при 1640 см~1 может быть обусловлено изменениями CN-конформации белковой молекулы. Для пероксидазы, выделенной из листьев инфицированных растений, возможен также сдвиг полосы,

88

/00 г

Длине бвлнйг , нм

Рис. 21. Инфракрасные спектры поглощения анионными изопероксидазами, выделенными из здоровых (/) и зараженных ВТМ (2) растений табака сорта Ксанти нк

характеризующей а-спираль в области 1655 см-1. Полученные данные могут служить показателем конформационных изменений в полипептидной цепи молекул анионных пероксидз и указывать на их различия. Таким образом, для «вирозных» пероксидаз (рис. 21, 2) в области 500—2000 см~ 1 имеются некоторые отличия от спектра контрольной пероксидазы, что может отражать изменения вторичной структуры молекул анионных изоэнзимов, обеспечивая тем самым высокую их активность в зараженных вирусами растениях.

Субстратная специфичность изоэнзимов. Установлено, что изменения в каталитических свойствах изоэнзимов обусловлены различиями в первичной структуре молекул изопероксидаз. В норме для пероксидазы растений табака эти различия проявляются в составе аминокислот и Сахаров [Mader, 1980; Mader et al., 1980, и др.]. Биохимическая характеристика пероксидаз, выделенных из вирозных и контрольных растений табака, показала определенные различия между ними по каталитическому действию на субстраты [Алябьева и др., 1983; Андреева и др., 1979; Андреева, Омельченко, 1986]. Вирусная инфекция, оказывая влияние на изопероксидазы растений табака, способствует снижению величин константы Михаэлиса по отношению к контрольной пероксидазе [Воронова и др., 1981]. Эти различия находят свое отражение в соотношении углеводной и белковой части молекул и служат причиной изменения активности пероксидаз зараженных растений.

Субстратную специфичность анионных пероксидаз исследовали, определяя спектрофотометрически величину поглощения продуктов реакции с применением субстратов естественной (хлорогеновая и кофейная кислоты) и искусственной (о-дианизиднн, бензидин, пирогаллол и гваякол) при-

89

Таблица 22

Скорость окисления субстратов анионными изопероксидазами растений табака сорта Ксанти нк

Субстраты Здоровые Инфицированные Инфицированные/ здоровые

D А D А о-Дианизидин 0,02 88,13 0,03 108,0 1,23

Гваякол 0,04 0,89 0,09 1,8 2,00

Пирогаллол 0,05 10,25 0,07 17,0 1,66

D — опт. плотность, 20 с; А — активность, мкМ/мин-мг белка.

роды. На основании коэффициентов экстинкции, которые равны 2,47 см~'-мМ-' для пирогаллола, 26,6 см_'-мМ-' для гваякола и 3- 104см '-мМ"' для о-дианизидина, рассчитывали скорость реакции фермент—субстрат. Было установлено, что окисление этих субстратов анионными пероксидазами вирозных растений идет в 1,5—2 раза быстрее, чем для контрольных пероксидаз.

В табл. 22 представлены данные по окислению искусственных субстратов анионными пероксидазами. Так, при одинаковом количестве взятого белка наибольшую активность проявляют сравниваемые изопе-роксидазы с о-дианизидином, затем идет пирогаллол и гваякол. Гваякол является субстратом, который окисляет только пероксидаза. Показано, что при окислении гваякола контрольной пероксидазой скорость реакции равна 0,89 мкМ/мин-мг белка, а для пероксидазы вирозных растений она в 2 раза выше и равна 1,8 мкМ/мин-мг белка. Для пирогаллола и о-дианнзидина скорость также выше у изоэнзимов зараженных растений. Высокая скорость окисления субстратов пероксидазами инфицированных растений, естественно, обусловлена более активным их состоянием.

Анионные пероксидазы вирозных растений занимают ключевое положение в листьях, обладающих вирусиндуцированной системной устойчивостью. На единицу белка активность этих изоэнзимов в 1,5—2 раза выше кон