ичины и для растений, зараженных слабовирулентным штаммом этого вируса (см. табл. 16).

Понижение Кт для исследуемых пероксидаз подтверждает существенные изменения биохимических свойств фермента в растениях, пораженных вирусами. Подобное было отмечено для пероксидазы капусты, зараженной грибной инфекцией (Botrytis cinerea), в качестве субстратов использовались пирогаллол, гваякол и флороглюцин [Кожанова, Аксенова, 1976]. Имеющиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что фермент пероксидаза может менять свои каталитические свойства под влиянием заражения растений-хозяев патогенами, а снижение Кт для пероксидазы инфицированных растений происходит в результате повышения ее сродства к субстратам.

6.4. АНИОННЫЕ ИЗОЭНЗИМЫ ПЕРОКСИДАЗЫ РАСТЕНИЙ КСАНТИ НК

Характеристика суммарных пероксидаз, выделенных из вирозных и контрольных растений табака, свидетельствует о различиях между ними по скорости инактивации этого фермента, чувствительности к изменениям рН среды и специфичности сродства к различным субстратам. Выше мы подробно рассмотрели данные о том, что в растущих тканях листьев вирозных растений значительно повышается уровень активности многих изоэнзимов, и особенно характерно это для анионных изопероксидаз. Остается повышенной активность этих изоэнзимов и во вновь отрастающих листьях зараженных растений табака сорта Ксанти нк. Поэтому изменение свойств суммарного препарата могло отражать изменение

Таблица 18

Результаты очистки пероксидазы табака сорта Ксанти ик после гель-фильтрации

Растения Активность, отн. ед./мг белка Степень очистки

Исходный препарат После G-I00 Инфицированные ВТМ 275 17 220 60,4

Здоровые (контроль) 119 7 715 64,8

Инфицированиые/здоровые 2,2 2,2 —

82

свойств и соотношение индивидуальных изоэнзимов. Следовательно, целесообразно выделить отдельные молекулярные формы этого фермента, и именно те, которые после электрофореза в полиакриламидном геле и при фокусировании на ПАГ-пластинках появлялись раньше контрольных и, следовательно, обладали более высокой активностью к таким субстратам, как бензидин, о-дианизидин и гваякол. В дальнейшем и была предпринята многоступенчатая очистка фермента пероксидазы до индивидуальных изоэнзимов согласно представленной схеме.

Схема выделения и очистки анионных изоэнзимов пероксидазы растений табака сорта Ксанти нк

500 г листьев + жидкий азот + 0,05 М трис-HCI буфер, рН 7,4 (1:1). Настаивание, высаливание до 40% насыщения (NH4)2S04, осадок отбросить. Супернатант до 80% насыщения, осадок растворить в 30%-ном р-ре сульфата аммония. Центрифугирование, VAC 1 ч, 40 000 g. Осадок отбросить. Высаливание до 80% насыщения, центрифугирование 30 мин, 16 000 g. Осадок растворить в 0,05 М исходном буфере. Гельфильтрация на G-100, G-200, супернатант до 80% насыщения.

Центрифугирование 30 мин, 16 000 g, осадок растворить в 0,001 М ацетатном буфере, рН 4,6. Ионообменное хроматографирование на ДЭАЭ-сефадексе А-50:ацетатный буфер + NaCl (0,2—0,6 М). Хроматографирование на СМ-сефадексе С-50 (3X50 см), 0,05 М ацетатный буфер, рН 4,8. Элюирование в градиенте рН 4,6—5,0 того же буфера.

Все операции при температуре +4°

Определения: белок по Лоури, активность по Бояркину. Электрофорез в полиакриламидном геле. Изоэлектрофокусирование на ПАГ-пластинках, рН 3,5—9,5. Определение субстратной специфичности, молекулярной массы, ИКС, состава Сахаров и др.

После всех этапов очистки лиофильно высушенный препарат анионных изопероксидаз составлял 10—12 мг, т. е. 0,02% от первоначальной массы.

При выделении ферментных белков все этапы очистки должны сохранять фермент в неизменном, приближенном к нативному состоянии. Профиль элюции пероксидазы после разделения на G-100 представлен на рис. 12. В табл. 18 и 19 приведены данные поэтапной очистки и соотношение очищенных препаратов из здоровых и зараженных ВТМ растений табака сорта Ксанти нк. После гель-фильтрации методом изоэлектро-фокусирования на ПАГ-пластинках было идентифицировано по 8 изопероксидаз для листьев как вирозных, так и контрольных растений табака. Изоэлектрические точки белков с пероксидазной активностью лежали в широком диапазоне рН — от 3,6, где фокусировался самый кислый изоэнзим, до 9,8 (точка фокусирования самого щелочного изо-энзима).

Интенсивность окраски изопероксидаз на электрофореграммах, по-

83

Таблица 19

Активность пероксидазы (в отн. ед./мг белка), выделенной из растений табака сорта Ксанти нк

Растения Исходный буфер, рН 7,4 Исходный буфер+О.г М NaCI

Инфицированные ВТМ 22 727 12 860

Здоровые (контроль) 10 376 6510-

Инфицированные/здоровые 2,2 2,0

лученных для препаратов вирозных растений, была значительно ярче, чем для контрольных. Доминирующими среди выявленных изоэнзимов были две анионные изопероксидазы с изоэлектрическими точками 3,6 и 3,8. При окрашивании ПАГ-пластинок в бензидине и последующем выдерживании их в растворе перекиси водорода именно эти изопероксидазы вирозных растений проявлялись раньше контрольных и всех других изоэнзимов. Согласно табл. 18, пероксидазная активность очищенных препаратов из инфицированных растений была в 2,2 раза выше контроля. Отношение активностей опыт/контроль оставалось неизменным и после очистки фермента на сефадексе G-100.

Дальнейшая очистка пероксидазы проводилась на ионообменнике ДЭАЭ-сефадексе А-50. Не удерживаемые ионообменником белки снимались исходным буфером, затем для элюирования использовали ступенчатый градиент буфера с добавлением хлористого натрия. При изменении ионной силы буфера элюировались искомые анионные изопероксидазы. Каталитическая активность этих пероксидаз с бензидином для вирозных растений оставалась в 2 раза выше контрольной (табл. 19). На рис. 19 дан спектр пероксидаз, элюируемых с колонки исходным буфером (а), и двух анионных изоэнзимов фермента (б), элюируемых буфером с добавлением 0,2 М NaCI. Спектр, приведенный на рисунке, соответствует только изопероксидазам вирозного растения, так как он для изоэнзимов пероксидазы здорового растения был идентичным.

Для более детальной очистки анионных изопероксидаз была предпринята ионообменная рехроматография на СМ-сефадексе С-50, который, удерживая другие белки, способствовал очистке анионных пероксидаз. Для элюции использовали ацетатный буфер рН 4,6—5,0. Как свидетельствуют данные табл. 20, удельная активность анионных пероксидаз после очистки на СМ-сефадексе С-50 значительно возросла и составляла для вирозных растений 180 844, а для контрольных — 118 515 отн. ед/мг белка. Сопоставляя пероксидазную активность исходного экстракта (после высаливания сульфатом аммония) с конечной активностью анионных пероксидаз, выделенных из вирозных и контрольных растений табака, видно, что фермент после всех этапов выделения был очищен более чем в 900 раз. Если отнести активность очищенного фермента к активности в ткани исходных листьев (см. табл. 12), то эта цифра будет еще на порядок выше.

Каталитическая активность анионных пероксидаз, выделенных из инфицированных растений, была в 1,5 раза выше контроля. Эта активность «вирозных» изопероксидаз является доказательством того, что,

84

Рис. 19. Схема изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинке белков с пероксидазной активностью, выделенных из растений табака, зараженных ВТМ, после хроматографироваиия на ДЭАЭ-сефадексе А-50

а— исходный буфер, рН 7,4; б — буфер +0,2 М NaCl

несмотря на сложный путь выделения и очистки фермента, повышение активности, обусловленное проявлением вирусиндуцированной устойчивости, в процессе очистки не изменилось. Изоэлектрофокусирование показало, что и опытный и контрольный препараты содержали по две анионные пероксидазы с очень близкими изоэлектри чески ми точками, в области рН 3,6 и 3,8. С этими изоэнзимами и были проведены дальнейшие исследования по изучению их физико-химических свойств.

Физико-химическая характеристика изоэнзимов. Так как выделенные нами две кислые изопероксидазы фокусируются на ПАГ-пластинках с амфолинами в очень узкой зоне рН, то последующая процедура их разделения на индивидуальные компоненты весьма затруднительна. Поэтому физико-химические характеристики были получены общие для этих двух изоэнзимов.

Определение моносахаров. Пероксидаза является ферментом глико-протеидной природы, имеющим в своем составе сравнительно большой углеводный «хвост», который, прикрывая белковую часть молекулы,

Таблица 20

Результаты очистки пероксидазы табака сорта Ксанти ик

Этап Белок, мг/мл Активность, отн. ед./мг белка Степень очистки Здоровые Зараженные Здоровые Зараженные Здоровые Зараженные

Центрифугирование, 10,60 9,0 123 193 1 1

40 000 g

Гель-фильтрация, 0,51 0,47 10 182 19 688 83 100

G-200

Рехроматография, 0,16 0,15 118515 180 844 960 940

СМ-сефадекс

85

стабилизирует ее. Известно также, что изменение термостабильности пероксидазы может происходить в результате изменений в углеводной части изоэнзимов. Все это обосновывает необходимость изучения качественного и количественного состава углеводов пероксидазы табака для выяснения причин увеличения активности у пероксидаз зараженных растений.

Определение и расшифровка углеводной части анионных пероксидаз были проведены по двум методам после предварительного ацетилирования Сахаров.

Хроматографию проводили на бумаге Filtrak FN-3 в системе растворителей н-бутанол:пиридин:вода (6:4:3). Для обнаружения моносаха-ров и аминосахаров использовали щелочной раствор азотнокислого серебра и 0,2% раствор нингидрина в ацетоне. Газожидкостную хроматографию проводили на хроматографе Pye-Unicaml04 с пламенно-ионизационным детектором на стеклянных колонках А-(150-0,4 см), содержащих 3% QE-1 на газохроме Q (100—120 меш). Моносахара анализировали в виде ацетатов полиолов (175—225°, 5°/мин).

Методом бумажной и газожидкостной хроматографии установлено, что изучаемые анионные изопероксидазы содержат в своем составе следующие моносахара: альдопентозу — фукозу; альдогексо