сами растений, окисляет о-дианизидин с максимальной скоростью при рН 5,0, что согласуется с данными Мэдера и др. [Mader et al., 1977]. Не обнаружено влияние вирусной инфекции на рН-оптимум проявления активности пероксидазы, выделенной из растений разных сортов табака: Ксанти нк и Самсун (сист.) [Андреева и др., 1979].

Определение термостабильиости фермента. Термическую стабильность пероксидазы определяли по скорости инактивации ее в растворе при

Таблица 14

Изменение активности (в ед. опт. пл./с-Ю-3) пероксидазы растений табака в зависимости от рН и продолжительности опыта

рН 0 ч 1 ч 14 ч 38 ч 7 сут 8 сут Остаточная активность, %

4,6 12,6 11,3 8,1 8,2 7,6 7,0 55,5

7,4 7,4 7,3 6,0 5,7 6,3 6,6 89,2

8,5 2,6 2,6 2,3 2,2 2,3 2,3 88,4

76

Рис. 14. Окисление о-дианизидина пероксидазой, вы деленной из здоровых (/) и зараженных (2) тканей табака сорта Ксанти нк при различных значениях рН

Рис. 15. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых инактивации пероксидазы, выделенной из здоровых (/) растений табака сорта Ксанти нк (а) и Самсун 47/10 (б), а также из зараженных Хт (2) и Ху (3) штаммами Х-вируса и ВТМ (4) соответственно

Условия инактивации; 0,01 М натрий-фосфатный буфер (0,1 М KNO3), рН 7,0 при 60". Условия определения активности пероксидазы: 0,2 мМ о-диаиизидии; 1 мМ Н2О2; 0,01 М иатрий-фосфатный буфер (0,1 М KNO3), рН 7,0

1

В рН

Щ1 втн.акт. '/.)

Щ ,(втк.ект.%)

180 Мим

температуре 60 и 72°. Для этой цели 3 мл раствора выделенного фермента вносили в специальные сосуды и инкубировали при рН 7,0 в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,1 М KNO3 при заданной температуре. Через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом 0,15 мл и вносили в 5 мл 0,01 М натрий-фосфатного буфера (20°). В каждой пробе определяли пероксидазную активность по начальной скорости окисления о-дианизидина перекисью водорода. Увеличение оптической плотности раствора регистрировали при 460 нм. Из экспериментальной зависимости активности фермента от времени инкубации находили эффективную константу скорости первого порядка для инактивации пероксидазы, которая является мерой термической стабильности фермента [Угарова и др., 1977].

Активность пероксидазы, выделенной из растений табака сорта Ксанти, при 60° и рН 7,0 через 90 мин опыта сохраняется в контроле на 12,4% от первоначальной, а пероксидазы из инфицированных ВТМ растений табака — лишь иа 5,1%. Такое снижение термостабильности свидетельствует о том, что вирусная инфекция оказывает существенное влияние, при котором изменяются физико-химические свойства фермента. Изучение тер-

77

Таблица 15

Константа скорости термоинактнвации (К н) пероксидазы, выделенной из листьев

Растения

Температура, "С /С„Х10 г, мин

Сорт Ксанти ик

здоровые (контроль) зараженные Хт-штаммом Ху-штаммом

Сорт Самсун 47/10

здоровые (контроль) зараженные ВТМ здоровые (контроль) зараженные ВТМ

60 60 60

60 60 72 72

1,4

2,5 2,5

1,4 1,6 1,35 1,73

мической стабильности фермента, выделенного из здоровых и зараженных растений табака сорта Самсун 47/10, также показало неодинаковое влияние температуры на препараты фермента. Полулогарифмические анаморфозы зависимости активности пероксидазы от времени инкубации при повышенной температуре представлены на рис. 15.

Кривые термоинактивации [Воронова и др., 1981] имели сложную форму, и условно на кинетических кривых можно выделить два участка, соответствующие быстрой и медленной стадиям инактивации. В табл. 15 приведены величины константы скорости медленной стадии термоинактивации выделенного фермента. Сопоставление кинетических зависимостей скорости инактивации указывает на различия в термостабильности пероксидаз, выделенных из зараженных и контрольных растений (рис. 15, а, б). Термостабильность пероксидазы здоровых и вирозных (ВТМ) растений табака сорта Самсун 47/10 различалась не так резко, как для пероксидазы растений Ксанти (рис. 15, а). Константа скорости инактивации фермента из растений этого сорта как при 60°, так и при 72° была также несколько выше у зараженных растений, но ниже, чем у пораженных растений сорта Ксанти. Следовательно, как при системном (Ксанти-|-Хт или Ху), так и при некротическом (Самсун 47/10 + ВТМ) поражении вирусная инфекция приводит к понижению термоустойчивости фермента пероксидазы. Константа скорости тепловой инактивации пероксидазы контрольных растений оказалась одинаковой для исследуемых растений двух сортов табака (табл. 15).

Выше отмечалось, что при заражении растений табака разными вирусами у фермента пероксидазы изменяется относительное содержание различных изоформ (см. рис. 13), а также интенсивность проявления их активности с субстратом. Препараты фермента этих же растений обладают пониженной термостабильностью. При значительно более высокой активности пероксидазы зараженных растений сорта Ксанти нк инактивация фермента при нагревании идет почти в 2 раза быстрее, чем для пероксидазы контрольных растений.

Сведений о влиянии вирусной инфекции на термостабильность фермента пероксидазы нет. Известно лишь, что при поражении растений грибной инфекцией скорость инактивации этого фермента также повы-

78

Таблица 16

Константы Михаэлиса для пероксидазы табака сорта Ксанти, М-10

Растения рН 7,0 рН 5,0 ДН2 н2о2 ДН2 Н202

Здоровые (контроль) Зараженные Ху Зараженные Хт 0,75+0,06 0,70 + 0,04 0,58+0,05 6,80 + 0,03 3,30 + 0,02 4,10+0,02 0,48+0,04 0,35 + 0,05 0,29 + 0,02 13,10 + 0,08 5,80 + 0,06 8,70+0,07

Таблица 17

Константы Михаэлиса для пероксидаз растений табака сорта Самсун (сист.) при рН 7,0

Ткань Kin' ю~4. м

о-Дианизидии н2о2

Здоровая (контроль) Зараженная ВТМ 0,76 + 0,03 0,49 + 0,05 4,80+0,01 2,50+0,04

шается [Кожанова, Аксенова, 1976]. Выделение и идентификация белков с пероксидазной активностью из вирозных и контрольных листьев свидетельствуют о возможной специфичности различий, выражающихся в изменении активности, изоэнзимного спектра, рН-оптимума и термостабильности фермента пероксидазы инфицированных растений-хозяев. Однако сущность и особенности изменения физико-химических свойств отдельных изопероксидаз под влиянием вирусной инфекции еще предстоит расшифровывать.

Кинетические свойства пероксидаз исследовали для фермента, выделенного из растений табака сортов Ксанти нк и Самсун (сист.), зараженных разными вирусами (ВТМ, Хт и Ху). Чтобы получить более полную характеристику фермента, активность пероксидазы определяли при рН 5,0 и 7,0, применяя в качестве субстрата о-дианизидин (ДН2). Начальную скорость окисления ДНг (Vo) измеряли при 460 нм [Угарова и др., 1977]. Кинетику реакций снимали на двухлучевом спектрофотометре В-2-25 («Весктап», США). Константы рассчитывали по методу Лайнуивера—Берка. Константу Михаэлиса (Km) для исследуемых пероксидаз получали из двух зависимостей: а) при постоянных концентрациях пероксидазы и ДНг и изменении концентрации Н2Ог; б) при постоянных концентрациях пероксидазы и Н2О2 и изменении концентрации ДН2.

На рис. 16 показана зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина (Vo) от концентрации в интервале от 0,13 до 1,4 отн. ед. активности/мг белка пероксидазы при насыщающих концентрациях обоих субстратов. Прямая пропорциональная зависимость между VD и концентрацией фермента соблюдается для всех препаратов пероксидазы, исследованных в работе. В процессе реакции не происходит ассоциации или диссоциации ферментов на субъединицы, не образуются неактивные димеры и не сказывается влияние возможных примесей.

79

0,0V 0,12 ООелл/шя дктиО/focmi, pm//. eO/мг Оелка

P и с. 16. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина от концентраций пероксидазы при рН 5,0 (/) и рН 7,0 (2), выделенной из растений табака ' сорта Ксанти нк

Рис. 17. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидииа от концентрации субстратов, катализируемого пероксида-зой, выделенной из здоровых (/), зараженных Ху (2) и X, (3) штаммами Х-вируса картофеля растений табака сорта Ксантн нк в прямых величинах (Л) и в координатах Лайиуивера—Берка {Б)

0.0

0,5 _ 1,0 [H2DZ] Ч03,М

'.О 2,0 f о -Д1/пмздОин]-/0 f М

m3/v0,c/M

? 8

10 /Со -ДитизиОин], М~

V„-f03,M/c VB-W~3,M/c

0,S /,0 1,0 2,0

[Hz 02] ¦ fP~J, M [о-Диамамёаи]• /О ,M

Б

Рис. 18. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина от концентрации субстратов, катализируемого пероксидазой, выделенной из здоровых (/) и зараженных ВТМ (2) растений табака сорта Самсун в координатах Лайнуи-вера—Берка

Условия те же, что и на рис. 17.

Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина при рН 7,0 от концентрации одного из субстратов при насыщающей концентрации другого для пероксидазы из здоровых и зараженных тканей табака сорта Ксанти и Самсун имеет гиперболический характер (рис. 17, 18). Аналогичный характер указанная зависимость имеет для пероксидазы растений табака сорта Ксанти при рН 5,0 [Воронова и др., 1981]. Обработка экспериментальных данных в координатах Лай-нуивера—Берка позволила сделать вывод, что окисление о-дианизидина, катализируемое пероксидазой табака, подчиняется уравнению Михаэлиса—Ментен. Константы Михаэлиса для различных пероксидаз были получены из двух вариантов зависимостей: 1) не меняли концентрацию пероксидазы или ДН2, но меняли количество Н202 (рис. 17, 18,

81

слева); 2) не меняли концентрацию пероксидазы и Н2Ог, но изменяли содержание ДН2 (рис. 17, 18, справа).

В табл. 16 и 17 представлены числовые значения Кт для пероксидазы здоровых и зараженных растений табака двух сортов, вычисленные из их линейных зависимостей для каждого из субстратов. Из данных таблиц видно, что вирусная инфекция оказывает влияние, в результате которого снижаются величины константы Михаэлиса для пероксидаз как при рН 7,0, так и при рН 5,0. Величина Кт снижается по о-дианизидину на 20—40% и по Н202 на 30—40% для растений табака сорта Самсун, зараженных ВТМ, и растений сорта Ксанти нк, зараженных сильновирулентным штаммом ХТВК. Имеет место уменьшение этой вел