истьях также выше контроля, но только в 2 раза.

Данные, полученные нами по распределению активности фермента пероксидазы в разных зонах листа и в различных листьях, особенно интересны в связи с тем, что в темных и светлых зонах содержится разное количество вирусных частиц. Для растений табака сорта Самсун было установлено, что в темно-зеленых зонах присутствует лишь 20% вирусных частиц ВТМ по отношению к контрольным листьям [Kluge, 1976, 1983]. Из темно-зеленых островков после регенерации можно получить до 50% растеньиц, свободных от вирусных частиц [Murakishi, Carlson, 1976]. Авторы считают, что в листьях таких безвирусных растений присутствует какой-то фактор, подавляющий размножение ВТМ. Установлено также, что содержание общего и растворимого белка на 28—68% выше в темно-зеленых участках по сравнению со светлыми [Kluge, 1983]. Авторы полагают, что обнаруженные различия связаны с активным проявлением устойчивости к ВТМ в темно-зеленых зонах.

В темных участках выше содержание пероксидазы и меньше вирусных частиц, а в светлых участках и в нижних листьях наоборот. Следовательно, есть обратная коррелятивная зависимость между активностью пероксидазы и репродукцией ВТМ. Высокий уровень активности фермента, очевидно, тесно связан с проявлением устойчивости к ВТМ в темных участках исследуемых листьев.

72

6.2. АКТИВНОСТЬ ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ПОРАЖЕНИИ

Для выяснения взаимосвязи между количеством вирусных частиц в инокулюме, числом некрозов, появляющихся в ответ на заражение устойчивых растений, и проявлением активности пероксидазы при этом был поставлен следующий эксперимент. Листья среднего яруса растений табака сорта Ксанти нк заражали вирусом табачной мозаики, применяя инокулюм с различной концентрацией вирусных частиц—10, 100 и 200 мкг/мл. После появления некрозов листья отбирали в пробы для подсчета количества некротических пятен и определения активности фермента в них. На основании подсчета установлено, что увеличение числа некрозов прямо коррелирует с повышением содержания вирусных частиц в инокулюме. Активность фермента не зависела от концентрации вируса в суспензии и от количества некрозов на инокулированных листьях и была в 2,5—3 раза выше, чем в контроле (табл. 11).

При инокуляции вирусом в концентрации 10 мкг/мл на листьях обнаружено в среднем по 28 некрозов и активность равнялась 5,15 отн. ед./г сырой ткани. При нанесении вируса в концентрации, в 20 раз превышающей указанную, количество некрозов на листьях было почти в 8 раз больше, тогда как активность фермента практически оставалась на том же уровне. Эти данные свидетельствуют об отсутствии связи между активностью пероксидазы и числом некрозов на инокулированных листьях. В противном случае увеличение числа некротических образований с 28 до 220 привело бы к более высокому уровню активности исследуемого фермента. Таким образом, установлено, что повышение активности пероксидазы не определяется числом некрозов, появляющихся на инокулированных листьях исследуемых растений.

Ранее нами было показано, что количество вирусных частиц, присутствующих в листьях зараженных растений, также не коррелирует с величиной активности этого фермента (см. 5.5) и активность зависит лишь от патогенности штамма Х-вируса картофеля. Следовательно, ни количество некрозов на листе, ни количество вирусных частиц в зараженном листе не имеет прямой связи с активированием фермента пероксидазы. Для проверки этого вывода было определено изменение активности фермента пероксидазы в листьях разных ярусов и возраста после заражения нижних листьев растений табака сорта Ксанти нк.

Установлено, что через 5—6 дней после заражения ВТМ в самых молодых, только отрастающих листьях активность пероксидазы повы-

Таблица 11

Влияние ВТМ на активность пероксидазы листьев табака сорта Ксанти нк

Растения

Концентрация вируса, мкг/мл

Число некрозов Активность, отн. на лист ед./г сырой ткани

Здоровые (контроль) Зараженные ВТ-М

0 10 100 200

0 28 97 220

1,83 5,15 4,90 5,53

73

Таблица 12

Активность пероксидазы (отн. ед./г сырой ткани) в листьях разного яруса растений табака сорта Ксанти нк

Растения Верхний, 7—9 см Верхний, 12—16 см Средний

Инфицированные ВТМ 19,53 21,04 31,57

Здоровые (контроль) 8,67 6,93 18,37

Инфицированные/здоровые 2.25 3,05 1,7

шается незначительно. В молодых листьях, имеющих длину листовой пластинки 7—9 см, активность фермента увеличивается в 2 и более раза по сравнению с контролем (табл. 12). В листьях зараженных растений, имеющих длину 12—16 см, активность пероксидазы была в 3 раза выше контроля. Следует отметить, что в отрастающих листьях такого же размера активность фермента также остается высокой и после того, как нижние некротизированные листья опадут. Этот феномен лишний раз подчеркивает, что активирование пероксидазы в этих листьях связано с защитной функцией растения-хозяина и зависит от фактора (возможно, ее субстрата), индуцирующего каталитическую деятельность фермента на сравнительно длительный промежуток времени.

В листьях среднего яруса, закончивших рост, активность фермента могла быть в 1,5—3 раза выше контрольной. Полученные данные представляли интерес для выбора яруса листьев, из которых выделяли фермент, необходимый для дальнейшего изучения каталитических и физико-химических свойств пероксидазы в связи с вирусным поражением.

6.3. ХАРАКТЕРИСТИКА СУММАРНЫХ ПЕРОКСИДАЗ РАСТЕНИЙ ТАБАКА

Для более детальной характеристики фермента были проведены выделение, частичная очистка и сравнительное изучение физико-химических свойств пероксидазы из листьев табака сортов Ксанти и Самсун, зараженных разными вирусами (ВТМ, Хт, Ху). Заражение растений, взятие проб и выделение фермента проводили, как описано ранее [Андреева и др., 1979]. Растения сорта Ксанти на заражение Хт и Ху-штаммами вируса картофеля отвечают системным поражением. При этом суровый Хт-штамм в процессе развития инфекции вызывает образование светлых колец, а слабопатогенный Ху-штамм не дает симптомов заболевания совсем. Однако и в том и другом случае активность пероксидазы после заражения возрастала и составляла 180% для растений, пораженных слабопатогенным штаммом, и 240% для пораженных сильнопатогенным штаммом по отношению к контролю (табл. 13).

Согласно данным табл. 13, препарат фермента очищен в 250 раз. Хроматографический профиль элюции пероксидазы после разделения на сефадексе G-100 идентичен для здоровых и инфицированных растений (рис. 12). Фракции с наибольшей пероксидазной активностью (отмечены штрихом) использовали для последующей работы. Методом диск-электрофореза в спектре пероксидаз, выделенных из здоровых и вирозных

74

Таблица 13

Результаты очистки пероксидазы, выделенной из листьев табака сорта Ксанти нк

Активность, отн. ед./мг белка % к контролю Листья Исходный экстракт после центрифугирования После очистки Степень очистки Исходный экстракт после центрифугирования После очистки

Здоровые 0,16 47,37 254 — (контроль)

Зараженные 0,30 74,10 244 186,5 180

Ху-штаммом

Зараженные 0,38 95,45 259 235,5 240

Хг-штаммом

растений табака сорта Ксанти, было идентифицировано по 10 изоэнзимов. Активность отдельных изопероксидаз в препаратах из зараженных растений была значительно интенсивнее, чем в контроле, при одинаковом количестве наносимого на гель белка (рис. 13).

Молекулярная масса исследуемых пероксидаз была определена методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100, откалиброванной по стандартным белкам. Выход белков с колонки контролировался автоматически по оптической плотности на Uvicord II марки 8300 с самописцем фирмы ЛКБ (Швеция). Суммарная молекулярная масса сравниваемых пероксидаз оказалась равной 40 кДа. Различий по молекулярной массе между изопероксидазами здоровых и вирозных растений мы не обнаружили. Пероксидазы растений табака сорта Барлей были выделены и разделены на три группы с молекулярными массами 27, 43 и 47 кДа [Nessel, Mader, 1977]. Определение молекулярной массы изоэнзимов А, Сз и С4, выделенных из культуры ткани табака разновидностей W-38 и WR-132, показало, что она может быть равной 46, 67 и 90 кДа [Powell et al., 1975]. Эти данные свидетельствуют о том, что молекулярная масса индивидуальных изоэнзимов пероксидазы растений табака существенно различается, а в основе этих различий лежат их физико-химические свойства.

Активность при различных значениях рН. Для исследуемых пероксидаз проверена стабильность фермента при различных значениях рН. Для этого аликвоты фермента помещали в разные условия среды инкубации и через определенные промежутки времени измеряли пероксидаз-ную активность (табл. 14). В опыте были использованы те значения рН, которые соответствовали буферным растворам, обычно применяемым в процессе выделения и очистки фермента. Данные табл. 14 показывают, что в кислой среде (рН 4, 6) активность фермента более высокая, но фермент менее стабилен. Так, спустя 8 сут от начала опыта при инкубации в этих условиях активность пероксидазы снизилась почти вдвое.

При более высоких значениях рН активность падает незначительно.

75

Номер франции |_| I I |_| +

Рис. 12. Гель-фильтрация пероксидазы растений табака сорта Ксанти нк на сефадексе G-100 (1,5X30 см)

/ — белок; 2 — активность Рис. 13. Изоферментный спектр пероксидазы здоровых (а) и зараженных штаммами Ху (б) и Хт (в) растений табака сорта Ксанти нк

Через 8 сут от начала опыта активность фермента при рН 7,4 и 8,5 упала лишь на 11 —12%. Следовательно, слабощелочная среда является наиболее стабилизирующей для исследуемых пероксидаз. Однако через час после начала опыта исходная активность фермента при щелочных значениях рН была значительно ниже, чем измеренная в кислой среде. Согласно данным табл. 14, активность пероксидазы табака при рН 8,5 составляла 2,6 единицы и была в 5 раз ниже активности фермента при рН 4,6.

Для пероксидазы здоровых и зараженных растений табака зависимости активности от рН среды совпадают (рис. 14). Как видно на рисунке, фермент, выделенный из здоровых и зараженных виру