ях между ними [Воронова и др., 1981]. Применение хрома-тографических методов исследований позволило выделить два белка с пероксидазной активностью и изучить некоторые каталитические свойства их в опыте и контроле [Андреева и др., 1979; Андреева, 1981]. Это дало возможность получить новую информацию об активности изопероксидаз вирозных растений.

Из работ, вышедших за последнее время, наибольшее внимание заслуживает коллективный труд авторов «Биохимия иммунитета, покоя, старения растений» [1984], выполненный в Институте биохимии им. А. Н. Баха. Изучая различные стороны метаболизма растений, пораженных грибными заболеваниями, авторы дают анализ различных биотических индукторов защитных реакций растений и возможные пути их практического использования. Однако в нем не проанализированы сведения о биохимии защитных реакций растений, зараженных вирусами. Взаимодействие растений-хозяев и вирусов, их поражающих, происходит иначе, чем при заражении грибами и бактериями, так как у вирусов нет

5

собственной ферментной системы. Вирус индуцирует в клетках растений* процессы, полностью зависящие от метаболических путей хозяина. К тому же один и тот же вирус может вызывать различную реакцию у разньш хозяев, а разные вирусы — неидентичные реакции у одного и того же хозяина. В настоящее время мы имеем, как правило, разрозненный мате* риал, полученный на растениях-хозяевах в различные сроки заражения и взятия проб для эксперимента. Исследователи выделяют отдельные мета4 болические реакции и на их основе пытаются понять взаимодействие вирус—растение. Очевидно, совершенно необходимо проводить исследования на одном растении-хозяине, поражаемом как вирусным, так и грибным заболеванием, в целях четкого понимания общих закономерно! стей и определенных различий в путях иммунных процессов инфицирован-, ных растений.

Современная сельскохозяйственная практика (посев семенами одного сорта на больших площадях, применение фунгицидов, инсектицидов и т. д.) способствует возникновению новых рас патогенов, которые могут в сильной степени поражать ранее устойчивые сорта растений. Если в прежние годы сорта могли сохраняться 2—3 десятилетия, то теперь устойчивость к возбудителям теряется уже через 5—7 лет [Конарев, 1985]. В условиях промышленного возделывания растений из природной популяции могут выделяться и накапливаться сильновирулентные штаммы вирусов, поражающие постоянно высеваемые культуры. Все это определяет необходимость глубокого изучения биохимических основ механизмов фитоиммунитета, а полученные теоретические разработки более эффективно использовать для приемов борьбы и защиты растений от патогенов.

Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО АН СССР кандидатам химических наук Олегу Борисовичу Максимову, Раисе Петровне Горшковой и Нине Арвидовне Василевской за консультацию и помощь в выполнении работ по определению углеводов и фенольных соединений, а также Светлане Ильиничне Омельченко, принимавшей активное участие в проведении совместных исследований.

Г ЛАВА 1

ПЕРОКСИДАЗА — ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА

Проявление пероксидазной функции у биологических объектов было замечено еще в прошлом веке, на заре изучения органических веществ. Самое раннее сообщение о пероксидазе появилось в 1855 г., после того как Шенбейн провел окисление ряда органических соединений разбавленными растворами перекиси а присутствии экстрактов из растений и животных [Saunders et al., 1961]. Название «пероксидаза» дал Линозье ферменту, выделенному им из гноя лизированных лейкоцитов и катализирующему окисление разных соединений за счет перекисного кислорода (Linossier, 1898, цит. [Михлин, 1947]). Линозье первым привел различия между «оксидазами» и «пероксидазами». Как пишет Д. М. Михлин, выделением пероксидазы в сравнительно чистом виде и изучением основных ее свойств мы обязаны Алексею Николаевичу Баху и его сотрудникам. В 1903 г. они выделили пероксидазу, относительно свободную от других ферментов (в том числе от каталазы), чем было окончательно опровергнуто долгое время господствовавшее мнение о тождественности пероксидазы и каталазы.

А. Н. Бах и Р. Шода для оценки активности растительной пероксидазы использовали окисление пирогаллола до окрашенного пурпурогаллина (Bach, Shodat, 1903, цит. по: [Роговин и др., 1977]). Они нашли, что скорость образования пурпурогаллина пропорциональна концентрации .фермента и перекиси водорода. Этим методом пользуются биохимики и поныне для оценки активности как растительных, так и животных пероксидаз. В дальнейших исследованиях были определены оптимум действия пероксидазы, температурная зависимость, оптимум концентрации водородных ионов, установлено также значение концентрации субстрата в реакциях с ферментом и т. д. Для уровня исследований тех лет это было значительным шагом вперед в области изучения белков-ферментов растений. Именно тогда А. Н. Бахом была высказана гипотеза об участии перекисей в окислении органических соединений.

С годами интерес к ферменту пероксидазе не ослабевал. В 30—50-е годы внимание многих исследователей было приковано к таким геми-новым белкам, как пероксидаза, каталаза, цитохромы и гемоглобин. Подтверждением тому служит работа Д. М. Михлина «Пероксиды и пероксидазы», вышедшая в 1947 г. В 60—70-е годы большое внимание уделялось пероксидазам больного растения на кафедре физиологии

растений МГУ членом-корреспондентом ВАСХНИЛ Б. А. РубиныЛ и его сотрудниками. В 80-е годы на кафедре химической энзимологии МГУ, возглавляемой членом-корреспондентом АН СССР И. В. Бере! зиным, успешно велось изучение каталитических свойств пероксидазы, вы! деленной из растений хрена. Согласно сводке литературы, представленное швейцарскими и канадскими исследователями, только с 1970 по 1980 г. вышло из печати 1600 научных статей [Gaspar et al., 1982], посвященных этому ферменту. В них освещены различные стороны физико-химического строения, биологического действия и участия в метаболических процессах пероксидаз, в основном растительного происхождения. Представленный авторами список работ не является полным, так как не были учтены работы, касающиеся пероксидаз микро- и макроорганизмов.

Повышенное внимание к этому ферменту прежде всего вызвано тем, что до сих пор остается невыясненным наличие большого набора изоэнзимов (от 3 до 42) у многих исследуемых растительных пероксидаз. Скандалиоз считает пероксидазы «семейством» ферментов со сходными физиолого-биохимическими свойствами, где многое еще необходимо выяснить [Scandalios, 1969]. Другой, не менее интересный вопрос заключается в широкой субстратной специфичности или, в узком понимании этого определения, в отсутствии таковой для пероксидаз. Установлено, что пероксидазы неспецифичны в отношении доноров водорода, но строго специфичны а отношении второго субстрата — перекиси водорода при проявлении пероксидазной функции фермента. Возможное участие пероксидаз в защитных реакциях или в других проявлениях патогенеза также способствует сохранению постоянного внимания исследователей к этому ферменту.

1.2. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ

Пероксидаза — двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание активной группы, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и коллоидального белкового «носителя», усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 A [Clementi, Palade, 1969], который содержит около 43% а-спираль-ных участков в составе белковой части молекулы [Strickland, 1968]. По номенклатуре ферментов, принятой на Международном биохимическом съезде в 1979 г., пероксидаза — фермент, действующий на перекись водорода в качестве акцептора. Единственный подподкласс (1.11.1) составляют пероксидазы, где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза — донор: Нг СЬ-оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7), о каталитическом действии которой более подробно будет сказано ниже.

Изученные до настоящего времени пероксидазы состоят из неокрашенного гликопротеина и соединенного с ним коричнево-красного ферри-порфирина. Геминовая часть молекулы (гем, гемин)—железопротопор-фирин IX представлен на рис. 1. Выполняя роль активного центра, он участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов [Renneuberg

Рис. 1. Схема строения гема и его связи с апоферментом в пероксидазе

et al., 1981]. Простетическая группа пероксидаз хрена и японской редиски, цитохрома с, хлоропероксидазы известна как феррипротопорфи-рин IX. Полагают, что все известные пероксидазы и их изоформы содержат этот гем, поскольку они ингибируются азидами и цианидами.

Пероксидаза

Протогематин IX Гликопротеин

Fe3* Протопорфирин IX

Феррипротопорфирин IX входит в активный центр, составляя порфи-риновое кольцо гема, являющегося высокоароматичным и гидрофобным соединением. Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового макроцикла с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы. Известно, что протопорфирин оказывает важное стабилизирующее влияние на белковую глобулу гемсодержащих ферментов. Так, комплексообра-зование апопероксидазы хрена с гемином резко повышает устойчивость белка к действию ультрафиолета и тепла. Удаление простетической

9

группы фермента ведет к потере пероксидазной активности, но не ска1 зывается на ее оксидазной функции [Siegel, Galston, 1967а].

Хилл и Холден в 1926 г. впервые добились успеха в расщеплении молекулы пероксидазы на простетическую группу и протеин, применяв обработку соляной кислотой и ацетоном [Maehly, 1952]. Маэли [Maehly. 1952], используя различные приемы щелочного и кислотного гидролиза гем-протеиновой связи, показал, что при нейтрализации щелочью НСЫ расщепляющего раствора в присутствии подходящего буфера происхо-1 дит рекомбинация протогемина и протеина в активную пероксидазу] И эта обратимая реакция может быть повторена несколько раз с тем же энзимом без заметных потерь активности. Автор также отметил, чтя белок пероксидазы хрена устойчив при щелочном рН, а цвет ге