пика, элюируемые буфером с добавлением 0,4 М NaCl, также существенно различались. Так, в контроле изоэнзимы перок-

67

сидазы электрофоретически не обнаружены, тогда как фракция из листьев зараженных растений дала три четкие полосы с пероксидазной активностью. В суммарном белке из неинфицированных листьев эти изоэнзимы присутствуют в минимальном количестве и улавливаются лишь весьма чувствительной качественной реакцией, а в аналогичной фракции из листьев зараженных растений содержание их значительно выше и обнаруживаются они очень четко как по качественной реакции, так и электрофоретически (рис. 7, 3).

Остается открытым вопрос: специфичны ли наблюдаемые нами различия для вирусного поражения? Можно предполагать, что специфичны, так как для механического поражения и грибного поражения обнаружены свои различия в наборе и свойствах изоэнзимов ферментных белков [Кожанова, Аксенова, 1976; Lobarzewski, 1981].

Ниже мы более подробно остановимся на физико-химической характеристике изопероксидаз, выделенных из растений D. stramonium. С очищенным суммарным препаратом фермента контрольных и зараженных ХТВ К растений было получено как с искусственными (пирогаллол, гваякол, парафенилендинамин), так и с естественными (хлорогеновой и кофейной кислотами) субстратами по пять четко окрашенных зон (рис. 8, 1—5). И только с бензидином, наиболее чувствительным донором водорода, на электрофореграммах проявилось по семь изоэнзимов фермента (рис. 8, 6). С этим субстратом для сравниваемых пероксидаз обнаружено дополнительно еще два медленно движущихся изоэнзима с Rm 0,08 и 0,2.

Однако методом изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинках, содержащих амфолины в диапазоне рН 3,5—9,5, определено 14 белков с пероксидазной активностью (рис. 9). Из них три катионных с изо-электрическими точками — 9,4; 8,7 и 8,0; пять изоэнзимов нейтральных и слабокислых — 7,0; 6,7; 6,5; 6,3 и 5,9; остальные — кислые анионные белки с изоэлектрическими точками — 5,3; 5,0; 4,5; 4,2; 4,0 и 3,8. Итак, в составе изопероксидаз растений дурмана преобладают в основном кислые изоэнзимы фермента. Три быстро движущихся изоэнзима содержатся в наибольшей концентрации. Именно для этих пероксидаз из зараженных ХТВК растений интенсивность окраски и скорость проявления с различными субстратами идут всегда быстрее, чем в контроле [Андреева, Омельченко, 1985].

Различия в количестве изопероксидаз, полученные методом электрофореза (рис. 8) и при изоэлектрофокусировании (рис. 9), очевидно, происходят от того, что при электрофорезе некоторые изоэнзимы движутся в электрическом поле вместе и занимают одинаковое положение. Факты эти в литературе описаны. При изоэлектрофокусировании амфолины, входящие в состав геля, способствуют более четкому разделению белковых препаратов, удерживая белки в их изоэлектрических точках.

Для шести изопероксидаз растений дурмана была определена молекулярная масса, рассчитанная по относительной электрофоретической подвижности изоэнзимов пероксидазы для семи различных концентраций геля, и построен график зависимости концентрации геля — 100- (log Rm-• 100) [Hedrick, Smith, 1968; Бузун, 1976]. Так, для пероксидазы из листьев дурмана этим методом выявлено шесть изоэнзимов, причем при

68

/ Z J

Рис. 8. Схема зимограмм суммарной пероксидазы листьев дурмаиа с различными субстратами

/ — гваякол; 2 — парафенилендиамии; 3 — кофейная иислота; 4 — хлорогеновая кислота; 5 — пирогаллол; 6 — бензидин

рН

: (0 -S -

В 7

е

J,ff 4,2 J,D J,J S,3 е,з f,f 7,P

llll II I I III

9,ff 0,7 3,4

_1_J_'._L

6,7 i

fZ3Vf670 3 cM

Рис. 9. Изоэлектрические точки изоэнзимов суммарной пероксидазы в диапазоне рН 3,5—9,5

разделении белков в гелях низкой концентрации получено меньшее число изопероксидаз, чем в гелях с высокой концентрацией акриламида. При 4,8%-ной концентрации акрилакида определено всего четыре зоны с искомой активностью. Из них три изоэнзима отдельно, а три других передвигались в виде широкой зоны вслед за линией фронта (рис. 10, а). В 6%-ном геле выявлено пять изоэнзимов: четыре раздельных и два совмещенных. Начиная с 7,2%-ной и выше концентрации геля идентифицировано по шесть зон с пероксидазной активностью (рис. 10, в, г). На рис. 11 приведены линии регрессий изоэнзимов пероксидазы.

69

1

а 0 о г

- I / i I

- F ш I

][ Ж

- Ж ш Л

Ж Ж т ш Т

- ш-ш ш 7 Ш ш

_ _J

200

ч too

«к /00

/?0

/20

4,8 7,2

0,0

геля, %

Рис. 10. Электрофоретический спектр пероксидазы растений дурмана в гелях разной концентрации акриламида

а — 4,8%; б — 7,2; в — 8,4; г — 10,0%

Рис. 11. Линии регрессий I—VI для изоэнзимов пероксидазы растений дурмана

Rm медленно движущейся I зоны белка не изменялась в гелях разной концентрации, что говорит об очень низкой молекулярной массе. II и III зоны белков имеют молекулярную массу 49 и 58 кДа соответственно. Линии регрессий IV, V, VI изоэнзимов параллельны, что свидетельствует о близкой или одинаковой молекулярной массе этих белков, но о разной величине зарядов. Тангенс угла наклона линий регрессии небольшой, значит, масса этих белков очень низкая (рис. 11). Предположительно она лежит в пределах 10—14 кДа. Из шести изопероксидаз, определяемых электрофоретически, три быстродвижущиеся имеют одинаковую молекулярную массу, но различаются по заряду и, видимо, являются белками-конформерами.

Таким образом, на основании проведенных исследований было показано, что изоэнзимы пероксидазы растений D. stramonium имеют молекулярную массу от 10 до 58 кДа. Методом изоэлектрофокусировании выявлено 14 зон с пероксидазной активностью, следовательно, в составе изопероксидаз, выявленных электрофорезом, присутствует более чем шесть белков. Остальные белки имеют сходный заряд и подвижность в гелях разной концентрации, и их масса укладывается в пределы, идентифицированные методом электрофореза. Различия в молекулярной массе изоэнзимов изучаемого фермента подтверждают его физико-химическую гетерогенность. Выявленные 14 изоэнзимов с различными изо-электрическими точками, лежащими в пределах рН 3,8—9,4, свидетельствуют о том, что в состав фермента растений D. stramonium входят пероксидазы с различным рН-оптимумом биохимического действия на субстраты.

Таким образом, как показано в этой главе, активность фермента пероксидазы значительно повышается при действии вирусов разной природы (L, ХВК). Суровость патогена определяет более высокое значение активности. Отсутствует коррелятивная связь между повышением ак-

70

тивности пероксидазы и полифенолоксидазы. Оказывая влияние на метаболизм растения-хозяииа, вирус как индуцирует, так и иигибирует синтез изоэнзимов изучаемого фермента, о чем свидетельствуют электрофорег-раммы. Условия очистки фермента не изменяли соотношение активности пероксидазы опыт/контроль. Следовательно, есть возможность вести сравнительное изучение пероксидаз, выделенных из вирозных и контрольных растений, что весьма важно для сопоставления физико-химических характеристик фермента, необходимых для понимания каталитического действия пероксидазы в инфицированном растении.

ГЛАВА 6

ПЕРОКСИДАЗЫ РАСТЕНИЙ ТАБАКА

6.1. АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА ПРИ СИСТЕМНОМ ПОРАЖЕНИИ

Известно, что активность пероксидазы повышается как у растений-хозяев, реагирующих на заражение образованием некрозов, так и у растений с системным проявлением заболевания. Растения табака сорта Самсун (системный хозяин) реагируют на ВТМ (обыкновенный штамм) ярко выраженной мозаикой, состоящей из темно- и светло-зеленых зон. Для растений этого сорта была измерена активность фермента в разных зонах мозаичных листьев верхнего яруса на 15, 20, 35 и 40-й день после заражения нижних листьев. Установлено, что как в темно-зеленых, так и в светло-зеленых зонах активность пероксидазы выше, чем в контроле (табл. 9). Однако наиболее высокой активность была в темио-зеленых участках листовой ткани. Так, на 20-й день в темно-зеленых участках активность была в 7 раз выше, чем в контроле, а в светлых зонах выше лишь в 3 раза. Такое повышение активности пероксидазы в листьях верхнего яруса сохранялось на 35—40-й день после заражения, и в темных участках она была наиболее высокой.

Проверена также активность фермента в апикальной и базальной частях листьев среднего яруса, где симптомы заболевания выражены менее резко, чем в,верхних листьях. Оказалось, что активность пероксидазы в этих листьях была несколько ниже, чем в верхних, причем в ба-

Таблица 9

Активность пероксидазы (отн. ед./г ткани) в листьях здоровых и зараженных ВТМ растений табака сорта Самсун (сист.)

Время взятия проб после заражения Верхние листья, 12 см Темно-зеленые зоны Светло-зеленые зоны Здоровые

15-й день 20-й день 4,34 9,65 3,17 5,05 1,30 1,32

71

Таблица 10

Активность пероксидазы (оти. ед./г ткани) в разных участках листьев здоровых и зараженных ВТМ растений табака сорта Самсун (сист.)

Время взятия проб 1 Апикальная Базальиая

после заражения зона Здоровые зона Здоровые

15-й день 3,70 2,00 6,12 1,68

20-й день 4,82 2,47 6,24 1,80

зальной части листьев она была выше, чем в более старой — апикальной (табл. 10).

У растений табака сорта Самсун (сист.) были заражены самые верхние молодые листья и через 10 дней проверена активность фермента в зараженных и нижележащих листьях. Верхние, зараженные листья к этому времени имели слабо выраженную мозаику. Появилась мозаика и на трех нижележащих листьях. Однако на самых нижних листьях симптомы заболевания "к этому сроку еще отсутствовали. Активность пероксидазы, выраженная в отн. ед./г ткани, через 10 дней после заражения распределялась следующим образом:

Верхние Нижние Здоровые (контроль) 1,30 2,73

Зараженные ВТМ 4,53 5,48

Следовательно, при наличии симптомов заболевания активность фермента выше контроля в 3,5 раза, а при отсутствии симптомов в нижних л