еленному субстрату. Новацкий и Хемптон [Novacky, Hampton, 1968] пришли к выводу, что появление новых изоэнзимов связано со старением, так как при вирусной инфекции процесс старения в пораженных растениях идет горазо быстрее. Чант и Бейтс [Chant, Bates, 1970] в листьях зараженных растений обнаружили дополнительный белок с пероксидазной активностью и также' предполагают, что проявление этого изоэнзима может быть связано с преждевременным старением растения.

Однако с утверждением указанных авторов нельзя согласиться, поскольку в инфицированных растениях отмечено как появление новых изоэнзимов пероксидазы, так и исчезновение зон, обнаруженных ранее в здоровых органах исследуемых растений. Ели бы появление новых пероксидаз было связано только со старением, то при анализе разных органов одного и того же растения обнаруживались бы какие-то закономерные явления, но они не наблюдались. Наши данные свидетельствуют о том, что к концу вегетации (21-й и 40-й дни) белки с Rm, равными 0,60—0,61 и 0,67—0,68 соответственно, присутствуют только в спектре здоровых листьев, тогда как в зараженных органах эти зоны отсутствуют. Число изопероксидаз в листьях здоровых и вирозных растений (40-й день) было одинаково, а подвижность некоторых из них различна.

Возможен и другой путь повышения активности пероксидазы — переход в более активное состояние уже имеющихся изоформ фермента или изменение внутриклеточной локализации их. Однако экспериментальные данные, полученные с применением ингибиторов белкового синтеза [Farkas, Stahmann, 1966; и Shannon etal., 1971], показали, что изменение активности пероксидазы происходит в основном по первому пути и новые изоэнзимы появляются в результате биосинтеза, а не активации фермента.

63

На основании данных, полученных нами, можно сделать вывод, что вирус скручивания листьев, существенно изменяя метаболизм растения-хозяина, индуцирует и ингибирует синтез белков, обладающих пероксидазной активностью. Вопрос о том, вызывает ли заболевание специфическое изменение активности и спектра изоэнзимов, присутствующих в здоровых растениях, или подобное явление наблюдается и при старении, пока не выяснен. Изучение особенностей изоферментных спектров различных органов, обладающих разными физиологическими и биохимическими функциями, контроль за изменением спектра в присутствии вирусной инфекции, а также выделение и характеристика индивидуальных белков с соответствующей активностью могут быть одним из путей к выяснению биологической роли гетерогенности ферментных систем и их адаптивных особенностей.

5.5. ВЛИЯНИЕ РАЗНЫХ ШТАММОВ ХВК НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА

Известно, что разные штаммы одного и того же вируса различаются по физико-химическим свойствам и влиянию на растение-хозяин [Novi-kov, Atabekov, 1970; Мэтьюз, 1973; Nishiguchi et al., 1980]. Характер изменения активности пероксидазы при поражении растений разными по патогенности штаммами одного вируса исследован слабо. Мы сравнили уровень активности пероксидазы в листьях разных ярусов растений D. stramonium в первые дни развития инфекционного процесса с накоплением вирионов в тех же листьях исследуемых растений [Андреева и др., 1977]. Для заражения были взяты два штамма Х-вируса картофеля (ХВК): таежный — Хт-сильнопатогенный, идентифицированный и выделенный из растений сорта Харли и Ху-слабопатогенный, выделенный из растений картофеля сорта Кобблер [Рейфман, Колесникова, 1973]. Первый вызывает на листьях Gomphrena globosa некротизацию, сильную мозаику и сравнительно быстрое отмирание ткани, второй не дает внешних симптомов заболевания.

Два нижних листа заражали инокулюмом, содержащим 300 мкг/мл вируса. Через определенные интервалы времени (3, 5, 7, 10 и 15 дней) в листьях определяли титр вируса по количеству некрозов на половинках листьев растения-индикатора. Активность фермента измеряли в листьях нижнего, среднего и верхнего ярусов исследуемых растений. Было установлено, что в листьях всех ярусов растений D. stramonium, зараженных

Таблица 7

Активность пероксидазы (отн. ед. на 1 г сырой ткани) в листьях D. stramonium иа 15-й день после инокуляции

Ярус листьев Здоровые Зараженные Ху-штаммом Зараженные Хт-штаммом

Верхний Средний 14,7 12,7 22,4 26,1 95,0 76,0

64

Дни

Рис. 5. Активность пероксидазы в листьях дурмана разных ярусов

а — контроль; б — зараженные Х,-штаммом; в — зараженные Ху-штаммом; ярусы листьев: / — нижний, 2 — средний, 3 — верхний

сильнопатогенным штаммом ХТВК, активность фермента пероксидазы значительно повышена по сравнению с контролем (рис. 5). Особенно заметно это увеличение выражено в молодых листьях (рис. 5, б, 3), где через 5—7 дней обнаруживается достаточно высокое количество вирусных частиц. В дальнейшем активность остается высокой независимо от суровости проявления заболевания и снижения количества вирионов, вплоть до отмирания ткани. Так, на 15-й день после заражения Хт-штаммом активность пероксидазы в листьях верхнего яруса в 6,5 раза выше контроля, хотя количество вирионов в них к этому времени резко снизилось.

Совершенно другая картина наблюдается в растениях, инфицированных слабопатогенным штаммом. Активность пероксидазы в листьях всех ярусов этих растений по отношению к контролю изменяется незначительно (рис. 5,в), и это в то время, когда количество вирусных частиц Ху-штамма в листьях всех ярусов много выше, чем Хт. Из этого следует, что не концентрацией вирусных частиц определяется повышение активности пероксидазы, а его патогенностью (табл. 7). В среднем ярусе листьев вирусные частицы Хт-штамма обнаруживаются только на 10-й день, но активность фермента уже на 3-й день после заражения выше (рис. 5, б, 2), чем в здоровых листьях (рис. 5, а, 2). В дальнейшем активность пероксидазы заметно возрастает и на 15-й день в 6 раз превышает контроль (табл. 7), несмотря на то что количество вирусных частиц в листьях невелико. Нижние, инокулированные листья к этому времени уже опадают.

Следовательно, за один и тот же период времени в листьях растений D. stramonium накапливается разное количество вирусных частиц для слабо- и сильнопатогенного штаммов Х-вируса картофеля и нет прямой коррелятивной зависимости между количеством вирусных частиц и па-

3 Зак. 1188

65

тогенностью штаммов. Было также показано, что при заражении Ху-и Хт-штаммами вируса картофеля растений табака сорта Ксанти нк разница в активности фермента пероксидазы между здоровыми и инфицированными растениями весьма значительная [Андреева и др., 1979]. С учетом различия в повышении активности и изменения спектра пероксидазы зараженных растений были изучены физико-химические и кинетические свойства пероксидазы, выделенной из вирозных и контрольных растений.

5.6. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРОКСИДАЗ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ D. STRAMONIUM

Впервые для вирозных растений был выделен суммарный препарат фермента из растений дурмана, зараженных сильнопатогенным штаммом ХТВК [Андреева, Омельченко, 1978]. Результаты очистки пероксидазы приведены в табл. 8. Из полученных данных видно, что отношение специфической активности фермента из зараженных листьев к активности фермента из контрольных листьев осталось постоянным. Это говорит о том, что в процессе очистки активность не была потеряна и полученный препарат пероксидазы можно считать нативной формой энзима.

После разделения на сефадексах G-25, G-100 и хроматографирования методом ступенчатого градиента на ДЭАЭ-целлюлозе препарат фермента разделили на три группы, различающиеся как по изоэнзимному спектру, так и по активности. Общая активность препарата очищенной пероксидазы из контрольных растений была практически в 2 раза ниже активности препарата фермента, выделенного из инфицированных листьев. Неизменным оставался коэффициент отношения исходной активности к очищенной, как в опыте, так и в контроле он был равен 1,8. Этот показатель свидетельствует о том, что выделен препарат фермента, сохраняющий свою каталитическую нативность (табл. 8). Профиль элюции с ДЭАЭ-целлюлозы и электрофореграммы изоэнзимов фермента представлены на рис. 6 и 7.

Данные рис. 6, а свидетельствуют о том, что активность пероксидазы листьев инфицированных растений, вышедшая в первом пике (/), в 5 раз

Таблица 8

Результаты очистки пероксидаз из растений D. stramonium

Этап

Начальный, центрифу гирование, 30 ООО g Конечный, хроматография после ДЭАЭ-целлюлозы

Здоровые Инфицированные Х,ВК Активность (1). ед/мг белка Степень очистки Активность (2), ед/мг белка Степень очистки

450 1 800 1

25 730 57.1 48 290 60,4

Отношение (2):(1)

1,8 1,8

66

/О 30 ВО

во/го wo /о зо oo

Номер р/шкцш

00 НО

\

Р и с. 6

а — и фер+0,2 белок

Профиль элюции пероксидазы листьев дурмана с ДЭАЭ-целлюлозы нфицированные; б — контрольные; / — трис-HCI буфер, рН 7,4; 2 — бу-М NaCl; 3— буфер +0,4 М NaCI; сплошная линия — активность, пунктир —

а /

|__| i_i i_i i_j i_j i_i +

/ , 2 3 f 2 3

Рис. 7. Электрофореграммы фракций пероксидазы листьев дурмана, элюируемых с ДЭАЭ-целлюлозы

а — инфицированные; б— контрольные; / — трис-HCI буфер; 2 — буфер + 0,2 М NaCl; 3 — буфер+ 0,4 М NaCl

выше по отношению к контрольной (рис. 6, б, /). При этом общее> содержание белка во фракции этого пика было ниже, чем во фракции из здоровых листьев. Белок определяли по Лоури [Lowry et al., 1951]. Дальнейшее элюирование изопероксидаз при добавлении в буфер 0,2 М NaCl позволило (рис. 6, 2) выделить и идентифицировать на электро-фореграммах второго пика пять четко выраженных зон изоэнзимов фермента для контрольных растений, но лишь четыре для инфицированных (рис. 7, 2). Активность же последних при одинаковом количестве элюируемого белка, как и в первом пике, была выше, чем во фракции здоровых растений. Следовательно, не количество белка определяет активность изоэнзимов пероксидазы зараженных листьев, а их каталитическое состояние. Связано это изменение активности с деятельностью индивидуальных изопероксидаз, которые активизируются при инфицировании растений сильнопатогенным штаммом ХТВК.

Белки третьего