ри заражении верхних молодых листьев. Возрастание активности пероксидазы в нижележащем листе через 3 дня после заражения свидетельствует о том, что вирус, или «индуцирующий агент», активизирует деятельность этого фермента как в выше-, так и в нижележащих листьях. Для подтверждения этого вывода в другом опыте ино-кулировали самые верхние листочки, а пробы брали через 14 дней после заражения. При этом определяли изменение активности исследуемых ферментов в нижележащих листьях среднего яруса (рис. 3). 14 дней было достаточно не только для размножения вируса, но и для распространения его по всему растению. Однако, несмотря на столь длительное время, вирус не оказал влияния на активность фермента пероксидазы в нижележащих листьях этого растения. Направление повышения величин активности было от основания листа к его верхней доле как для пероксидазы, так и для полифенолоксидазы. Разброс величин активности по долям листа не превышал ±10 ед. для пероксидазы, что согласуется с контролем (см. рис. 2, а).

59

Р и с. 3 Активность пероксидазы и полифенолоксидазы в листьях растений картофеля сорта Пауль Вагнер через 14 дней после инфицирования верхних листьев вирусом L

Обозначения те же, что на рис. 2

Рис. 4. Активность пероксидазы и полифенолоксидазы в разных долях листьев растений картофеля сорта Пауль Вагнер здоровых (контроль) и с хронической вирусной инфекцией

Обозначения те же, что на рис. 2

Следовательно, вирус L, находясь в условиях интенсивно делящихся клеток растущих листьев, максимально обеспечивающих его размножение пластическим материалом, в течение определенного времени не распространяется в нижележащие листья растений картофеля. Отсутствие индуцированного повышения активности пероксидазы в нижележащих листьях является косвенным доказательством локализации вируса в верхних листьях исследуемых растений.

Как указывает Мэтьюз [1973], при инокуляции вирусом табачной мозаики самых молодых листочков хорошо развитых растений табака или томатов листья нижних ярусов могут длительное время оставаться безвирусными. И, чем старше растение, тем сильнее выражена тенденция к локализации инфекции.

Для фермента полифенолоксидазы в нижележащих 5-м и 7-м листьях этого же растения было отмечено некоторое повышение активности, и это лишний раз подтверждает отсутствие строгой корреляции в изменении активностей этих ферментов. Таким образом, данные опыта свидетельствуют о том, что при заражении самых верхних листьев активность пероксидазы в нижележащих листьях среднего яруса не изменяется длительное время. Незначительное увеличение активности полифенолоксидазы имеет то же распределение, что и в контроле, и не совпадает с данными, представленными на рис. 2 и 4 для инокулированного листа.

Активность при хронической инфекции. Изучению особенностей метаболизма растений, выращенных из больных клубней, уделяется значительно меньше внимания, чем метаболизму первично инфицированных растений. В растениях картофеля с хронической инфекцией вирус L

60

уже присутствует в клубнях, а по мере роста и развития вегетативной массы занимает все новые клетки, активно репродуцируясь в них. Представляло интерес выяснить топографию величин активности исследуемых ферментов в долях листьев среднего яруса растений картофеля сорта Пауль Вагнер, выращенных из вирозных клубней. Сравнивая активность пероксидазы в разных долях 5-го снизу листа с контролем, было установлено, что она во всех долях вирозного листа в 4—10 раз выше (рис. 4). Так, в верхней доле 5-го здорового листа активность пероксидазы равна 48, в верхней доле больного — 340 отн. ед. Разброс величин активности в противоположных долях листьев контрольных растений минимальный и не превышает ±5 ед. В опыте этот разброс активности в долях у основания листа зараженного растения составляет +25, а в средних долях ± 40 ед. Активность пероксидазы в долях у основания вирозного листа была в 2—3 раза ниже, чем в средних и верхних долях. Для контрольных растений таких отклонений величин активности в разных долях одного и того же листа мы не наблюдали.

В отличие от пероксидазы активность полифенолоксидазы в долях вирозного листа этого же растения была выше лишь в 1,5—2 раза по отношению к контролю. Разброс величин активности в долях листа не превышал ± 2 ед., это говорит о том, что в вирозном растении изменения в метаболизме полифенолоксидазы выражены гораздо слабее, чем в метаболизме пероксидазы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность пероксидазы, индуцируемая вирусом L, возрастает значительнее, чем активность полифенолоксидазы.

Высокая активность пероксидазы в разных долях исследуемых листьев дает основание предполагать, что вирус обусловливает напряжение метаболических процессов при хронической инфекции в течение всего вегетационного периода. Отсутствует прямая коррелятивная связь между повышением активности пероксидазы и активности полифенолоксидазы в разных долях вирозных листьев картофеля. Изменение метаболизма инфицированных растений связано прежде всего с окислительно-восстановительными процессами, в которых задействована пероксидаза.

5.4. ИЗОПЕРОКСИДАЗЫ РАСТЕНИЙ D. STRAMONIUM

Изучение изменений активности и спектра изоэнзимов пероксидазы при заражении вирусом L было продолжено на растениях дурмана, у которых лист морфологических более прост, чем у картофеля. Растения Datura stramonium реагируют на вирус скручивания листьев системным поражением — хлорозом листьев, проявляющимся на 21—25-й день после инокуляции. Исследования проводили в разные периоды инфекционного процесса: на 3, 7, 14, 21 и 40-й день после заражения вирусом [Андреева и др., 1973]. Белковые зоны с пероксидазной активностью были идентифицированы в полиакриламидном геле по их относительной электро-форетической подвижности (Rm) по методу Дэвиса [Davis, 1964] в модификации В. И. Сафонова и М. П. Сафоновой [1969]. Спектры изопероксидаз получены для листьев, средних жилок тех же листьев, стеблей и корней.

61

Таблица 6

Число изоэнзимов пероксидазы в растениях D. stramonium, здоровых и зараженных вирусом L

День после инокуляции

Орган 3-й 7-й 14- й 21- й 40-й

Здоро- Боль- Здоро- Боль- Здоро- Боль- Здоро- Боль- Здоро- Боль-

вые ные вые ные вые ные вые ные вые ные

Листья 8 6 6 6 8 6 6 6 7 7

Жилкн 5 6 5 6 5 6 7 7 6 6

Стебли 3 3 5 6 4 4 6 6 7 7

Корни 6 6 6 7 8 9 11 10 7 6

Сопоставление спектров изопероксидаз, проведенное с учетом динамики развития вирусной инфекции, показало, что под влиянием вируса L происходят существенные-изменения, отражающиеся на подвижности изоэнзимов этого фермета. Количественный состав изопероксидаз вирозных и контрольных органов различался на один-два изоэнзима и составлял 6—8 зон для листьев, 5—7 для средних жилок листа. В стеблях и корнях были обнаружены несколько большие различия между сравниваемыми образцами, соответственно от 3 до 7 в стеблях и от 6 до 11 зон в корнях (табл. 6). Наибольшее количество изопероксидаз выявлено для контрольных корней — 11 зон с пероксидазной активностью. Следует также отметить, что только в корнях были идентифицированы малоподвижные изоэнзимы с Rm 0,06 и 0,1. В основном же относительная электрофо-ретическая подвижность определяемых белков была в пределах Rm 0,15—0,68.

В листьях наряду с изменением в подвижности изоэнзимов происходит, видимо, и ингибирование синтеза отдельных белков с пероксидазной активностью. Так, установлено, что сразу после заражения (3-й день) н в середине инфекционного процесса (14-й день) в листьях контрольных растений присутствовало по 8 изоэнзимов фермента пероксидазы, тогда как в вирозных листьях —лишь по 6 зон. На 3-й день после инокуляции изменения отмечены в спектре среднеподвижных белков, где есть зоны с электрофоретической подвижностью, равной 0,33; 0,38; 0,49 и 0,51, зарегистрированные в спектре фермента инфицированных листьев. Следовательно, у среднеподвижных изопероксидаз идет какая-то перестройка, сопровождающаяся изменениями как состава, так и подвижности исследуемых белков [Андреева и др., 1973]. Анализируя спектры белков жилок, нужно отметить, что если в листьях больных растений происходит исчезновение двух белков на 3-й и 14-й день после инокуляции, то в жилках тех же листьев вирус индуцирует образование одной дополнительной белковой зоны (см. табл. 6).

Если сопоставить данные спектра белков по растению в целом, то изменения состава изопероксидаз отмечены также для стеблей и корней. Во всех органах исследуемых растений изопероксидазы представлены главным образом среднеподвижными и быстродвижущимися изо-

62

энзимами, и только в корнях идентифицированы малоподвижные компоненты изопероксидаз. Спектр белков пораженных корней на 7-й день после заражения состоял из 7 изоэнзимов пероксидазы, а в контроле — из 6 зон; на 14-й день в опыте — из 9, в контроле — из 8. При проявлении симптомов заболевания (21-й день) и к концу вегетационного процесса (40-й день) число изоферментов в вирозных корнях было ниже, чем в здоровых.

Под влиянием вируса происходит как ингибирование синтеза некоторых изоэнзимов пероксидазы, так и индуцированный синтез изопероксидаз de novo (см. ранее, 3.7).

Определение изоферментного спектра полифенолоксидазы показало, что в исследуемых органах D. stramonium обнаружено от 5 до 8 зон с полифенолоксидазной активностью. Здесь, так же как и в опытах с пероксидазой, появление дополнительных зон отмечено для жилок вирозных листьев [Андреева, Омельченко, 1976].

Перестройка в спектре изопероксидаз, обнаруженная в разных органах растений D. stramonium, зараженных вирусом L, вызывает ряд вопросов, и первый из них: зачем синтезируются новые изоферментные белки, когда изоэнзимы с аналогичной специфичностью присутствуют в клетке до заражения? Возможно, что вновь образованные изоэнзимы в меньшей степени подвергаются контролю со стороны клеточных регулирующих механизмов или имеют повышенное сродство к опред