, 1973; Рубин, 1975; Shirata et al., 1978]. Это не исключает возможности существования других механизмов участия пероксидазы в проявлении устойчивости, связанных, например, с непосредственным воздействием фермента на внедрение паразита, о чем говорилось выше (см. 3.2). Считается, что этот фермент влияет на проницаемость клеточных мембран путем окисления тирозиновых остатков белка оболочки патогена, препятствуя таким образом его внедрению в ткань.

Б. А. Рубин с соавт. [1973, 1975] предполагают, что активация

55

пероксидазы в тканях растений, инфицированных грибами, может проис-. ходить, во-первых, за счет пероксидазы, синтезируемой самим паразитом, во-вторых, за счет активации имеющихся в клетке изопероксидаз. Такое активирование вызвано либо воздействием различных соединений, образуемых патогеном или клеткой растения под влиянием инфекции, либо изменением физико-химического состояния самого белка фермента. Третий источник увеличения активности пероксидазы — синтез изоэнзимов в клетках растения de novo, о чем уже было сказано (см. 3.7).

Взаимодействие растений-хозяев и вирусов происходит иначе, чем при заражении растений грибами и бактериями, так как у вирусов нет собственных ферментативных систем. Для всех метаболических процессов и построения себе подобных частиц вирус использует пластический материал хозяина. Это взаимодействие зависит от устойчивости клеток растений и не является чем-то неизменным. Один и тот же вирус может вызывать различную реакцию у разных хозяев [Novacky, Hampton, 1968; Bell, 1981, и др.]. Развитие вирусной инфекции приводит к изменению активности окислительно-восстановительных ферментов в растениях как с местной, так и с системной реакцией на заражение [Wood, 1971; Loon, 1976b, 1979; Conti et al., 1982; Harrison, 1982].

Исследуя действие разных штаммов ВТМ на растения табака, Б. А. Рубин и И. В. Зелеиева [1964] обнаружили, что активность пероксидазы была повышена на протяжении всего опыта при заражении каждым из трех штаммов, но наиболее сильную активацию фермента вызывал подорожниковый штамм. Так, в листьях огурца, зараженных вирусом огуречной мозаики, активность пероксидазы резко увеличивалась и на 8-й день составляла 430% по отношению к контролю, а на 25-й — около 850%. Увеличение активности пероксидазы часто связывают с образованием токсических соединений, обусловливающих раннюю гибель инфицированных клеток, что препятствует распространению вируса [Коваленко, 1983; Schuster, Flemming, 1976]. В основе этих процессов лежит превращение фенолов до хинонов, обладающих токсическим эффектом. Усиление активности пероксидазы коррелирует с системно приобретенной устойчивостью табака сорта Самсун NN к вирусу табачной мозаики [Simons, Ross, 1970, 1971; Loon, 1976b].

Количественные изменения активности, появление новых компонентов в составе изопероксидаз при заражении растений вирусами позволяют предполагать особую физиологическую роль отдельных изоэнзимов пероксидазы в метаболизме растений, зараженных вирусами. Особенности развития местных некрозов и устойчивости у разных растений зависят как от генетической основы хозяина, так и от реализации в них информации, закодированной в вирусной нуклеиновой кислоте.

5.3. АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ И ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ В ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ, ЗАРАЖЕННОГО ВИРУСОМ L

Изучение спектров и активности различных белков растений-хозяев, пораженных вирусами, показало существенные качественные и количественные изменения в их составе, имеющие место на протяжении всего процесса патогенеза [Андреева и др., 1973; Андреева, Омель-

56

ченко," 1976, 1981]. Установлено, что вирус как индуцирует, так и ин-гибирует либо синтез, либо активность изоэнзимов ферментных белков — пероксидазы и полифенолоксидазы. Увеличение активности полифенолок-сидазы иногда соотносят с активированием изоэнзимов пероксидазы [Ладыгина и др., 1970; Лисицина, Рахимбаев, 1974; Tripathi, Verma, 1975; Vegetti et al., 1975], так как in vitro эти два фермента могут проявлять перекрывающуюся субстратную специфичность. Однако нет оснований считать, что все обстоит аналогично и in vivo. К тому же сведений о взаимосвязанном действии пероксидазы и полифенолоксидазы у растений, пораженных вирусами, слишком мало, чтобы делать определенные выводы. Исходя из этого, было необходимо проверить, коррелирует ли увеличение активности пероксидазы с изменением активности полифенолоксидазы при поражении растений вирусом L (вирусом скручивания листьев картофеля). Какова топография величин активности исследуемых ферментов в различных долях листьев зараженных растений?

Исследовали растения картофеля сорта Пауль Вагнер, выращенные в грунте и свободные от Х-, Y-, S- и М-вирусов. Растения отбирали визуально и с помощью серологических тестов со специфическими сыворотками. Одну группу заражали вирусом L, вызывающим системное поражение, другая служила контролем. Для инфицирования растений на листья здоровых кустов подсаживали вирофорную тлю (Myzodes persicae Sulz.). Растения с хронической вирусной инфекцией выращивали из клубней, зараженных вирусом L (двухлетняя репродукция). Анализировали листья среднего яруса, от 4-ге до 8-го, считая снизу. Опыты выполнены в фазе бутонизации.

Активность пероксидазы определяли по методу А. Н. Бояркина [ 1951 ], используя в качестве субстрата бензидин. Данные рассчитывали в относительных единицах на 1 мг белка либо на 1 г сырой ткани. Аналогичным методом определяли полифенолоксидазу [Бояркин, 1954], применяя субстрат — парафенилендиамин..

Опыты проведены с целью:

а) определить активность указанных ферментов в начале инфекционного процесса в выше- и нижележащих по отношению к зараженному листьях среднего яруса;

б) заразить самые верхние, интенсивно растущие листья растения-хозяина и определить активность пероксидазы и полифенолоксидазы в нижележащих листьях;

в) выяснить изменение активности изучаемых ферментов в средних листьях растений картофеля с хронической инфекцией вируса L. Для изучения индуцированной вирусом активности пероксидазы и полифенолоксидазы, как правило, заражают нижние листья, определяя активность ферментов в листьях вышележащих ярусов растений-хозяев. Мы определяли активность этих ферментов в инфицированном, а также в выше- и нижележащем листьях по отношению к зараженному [Омель-ченко, Андреева, 1981].

На рис. 2 показано, что в вирозном й контрольном растениях активность пероксидазы повышается в направлении от основания листа к его верхней доле (см. стрелки). У основания листьев она несколько ниже,

57

P и с. 2. Активность пероксидазы (а) и полифеноксидазы (б) в листьях растений картофеля сорта Пауль Вагнер через 3 дня после инфицирования вирусом L ПО—пероксидаза; ПФО — полифенолоксидаза; направление изменения активности; цифры — активность соответствующих ферментов, отн. ед.; 6—8 — ярусы листьев

чем в средних и верхних долях. Разброс величин активности в разных долях контрольного растения составлял ± 10, в вирозном— ±100 ед. Следовательно, в здоровом растении окислительно-восстановительные процессы, идущие с участием пероксидазы, проходят равномернее в разных долях листа, тогда как в вирозном скорости этих реакций подвержены резким колебаниям. Нижний и верхний пределы величин активности этого фермента также различаются. Если минимальная активность в контрольных долях составляет 33 отн. ед., то в вирозных— 141, максимальная — 53 и 340 отн. ед. соответственно.

Установлено, что через 3 дня после заражения активность пероксидазы во всех долях как инокулированного 7-го, так и в выше- и нижележащих листьях в 4—8 раз выше, чем в контроле. Представляет определенный интерес и то, что пероксидазная активность уже через 3 дня после инокуляции возросла в 4—5 раз в нижележащем 6-м листе по отношению к контролю. Однако известно, что вирус из мест проникновения вначале с потоком ассимилятов переносится в верхние, растущие органы растительного организма или обнаруживается в корнях и лишь затем распространяется по всему растению и поступает в близлежащие листья [Мэтьюз, 1973].

58

Согласно гипотезе Вестштейян [Weststeijn, 1976], в инфицированном участке в ответ на вирусное поражение очень быстро образуется «индуцирующий агент», который, распространяясь от клетки к клетке, обусловливает повышение активности фермента, участвующего в локализации вируса. В нашем опыте резкое повышение активности пероксидазы в нижележащем 6-м листе, очевидно, вызвано каким-то индуцирующим фактором, так как присутствие вирусных частиц в нем через 3 дня после инокуляции 7-го листа маловероятно.

Несколько иначе изменяется активность полифенолоксидазы в иноку-лированном листе. Для анализа были отобраны противоположные доли тех же листьев. Через 3 дня после инокуляции наибольшая по отношению к контролю активность обнаружена в доле у основания листа — 94 отн. ед., что в 2 раза выше, чем в верхней доле этого же листа (рис. 2, б). Таким образом, наименьшая активность полифенолоксидазы была в верхней доле листа, несколько выше — 70 отн. ед.— в средней и наивысшая — у основания листа. Как отмечено, для активности пероксидазы характерно противоположное направление повышения величин активности — от основания листа к его верхней доле. Активность пероксидазы в одной половинке верхней доли инокулированного листа была наивысшей (241 отн. ед.), а полифенолоксидазы в противоположной половинке того же листа — минимальной (47 отн. ед.). Эти данные очень наглядные и свидетельствуют об отсутствии прямой корреляционной связи между повышением активности пероксидазы и полифенолоксидазы в долях исследуемого листа.

Незначительное, на 14—20%, активирование полифенолоксидазы отмечено в вышележащем 8-м листе и на 10—28% в нижележащем 6-м по отношению к контролю. Такое изменение активности полифенолоксидазы не является определяющим, а полученные данные доказывают, что активность полифенолоксидазы достоверно повышается только в ино-кулированном листе (наиболее заметно—в доле у основания листа), и что нет коррелятивной связи между повышением активности пероксидазы и полифенолоксидазы.

Активность п