м общей активности фермента в инфицированных листьях появляются две новые пероксидазы, отсутствующие в контроле. Первая появляется на 3-й день после заражения, вторая — на 4-й. Применив ингибиторы белкового синтеза (пуромицин, актиномицин D, я-флуоро-фенилаланин), они установили, что эти, синтезированные de novo, белки проявляют пероксидазную активность. О появлении новых изоэнзимов пероксидазы в инфицированных вирусами листьях Physalis floridana Rydb. и Nicotiana glutinosa L. сообщается в работе Солимози с соавт. [Solymosy et al., 1967].. С этими данными согласуются результаты Чанта и Бейтса [Chant, Bates, 1970; Bates, Chant, 1970], которые нашли, что при инфицировании Nicotiana glutinosa вирусом табачной мозаики или Х-вирусом картофеля повышение пероксидазной активности сопровождается изменениями в изоферментном спектре. По данным Е. А. Ладыгиной [1971], заражение растений картофеля вирусом Y вызывает появление дополнительных изоэнзимов пероксидазы в листьях и через месяц после инфицирования. Такие же изменения отмечены и в листьях растений, выращенных из зараженных клубней.

В докладе Стаманна и Демореста на биологическом симпозиуме в Будапеште были представлены данные о влиянии вирусной, грибной и бактериальной инфекции на изменение активности и изоэнзимного спектра пероксидазы [Stahmann, Demozest, 1972]. Авторы отметили, что любое поражение растений приводит к быстрому увеличению актив-

41

ности фермента и изменению состава его изоэнзимов. При этом некоторые изопероксидазы могут исчезать, а другие синтезироваться de novo. Именно эти, синтезированные de novo, изоэнзимы определяют изменение активности фермента и проявление устойчивости к действию патогенов.

В этой главе рассмотрены некоторые вопросы защитных реакций, которые имеют место при заражении растений патогенами. В иммунитете живых организмов задействованы многие метаболические системы. При этом стимулируется дыхание, идет синтез «патогенезозависимых» белков и образование лигнина при росте и развитии некрозов. Не последняя роль принадлежит таким метаболитам, как этилен и пероксидаза. Проявление вирусиндуцированной устойчивости сопровождается не только увеличением активности изопероксидаз, но и синтезом некоторых из них de novo. Все вместе составляет и определяет тот защитный механизм, «контуры» которого должны в результате усилий многих и многих исследователей дать ключ к пониманию сущности реакций, лежащих в основе выражения иммунного ответа растений.

ГЛАВА 4

ФЕНОЛЫ — СУБСТРАТЫ ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ

4.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ МЕТАБОЛИЗМА ФЕНОЛОВ

Большинство ботаников и физиологов второй половины XIX в. склонились к мысли, что образование фенолов в тканях растений является средством для выведения высокоуглеродных компонентов из общего обмена веществ, своего рода экскреторным механизмом. И до сих пор проблема физиологической роли фенольных соединений является сложной и полна противоречий. Однако широкое распространение фенолов во всех важнейших тканях и органах растений свидетельствует о том, что эти соединения не могут быть второстепенными метаболитами растительного организма. Они участвуют практически во всех процессах жизнедеятельности растений, функции и свойства их очень разнообразны и до конца еще не изучены [Биохимия фенольных соединений, 1968; Beart et al., 1985].

Одна из важнейших функций фенолов — участие в окислительно-восстановительных процессах. Палладии высказал предположение, что дыхание растений связано с обратимым окислением и восстановлением некоторых фенольных соединений. Он считал, что акцептором водорода на конечных этапах дыхательного процесса растительных организмов являются окислительные (хинонные) формы фенолов, и назвал нх дыхательными хромогенами. Попеременно окисляясь и восстанавливаясь, фенольные соединения (хромогены) служат связующим звеном между водородом дыхательного субстрата и кислородом окружающей среды. В дальнейшем гипотеза Палладина получила поддержку в работах А. И. Опарина, в которых показано, что система хлорогеновая кислота — фенолоксидаза способна окислять такие природные субстраты, как аминокислоты, пептиды и даже некоторые белки [Запрометов, 1974].

42

Применение изотопной метки позволило установить, что основным местом образования фенольных соединений являются молодые ткани [Запрометов, 1985]. Высокая скорость синтеза при освещении, а также способность изолированных листьев к синтезу фенольных соединений из 14СОг привели к мысли, что образование фенолов в клетках мезофила идет в хлоропластах. В этих органеллах в процессе фотосинтеза с высокой скоростью образуются полифенолы сравнительно простой структуры, которые затем транспортируются в другие компартменты клетки. Показано, что до 95% общего количества синтезируемых фенолов находится вне хлоропластов.

Исходя из накопленных данных о внутриклеточной локализации ферментов, принимающих участие в биосинтезе фенольных соединений, можно предположить, что, помимо хлоропластов, в клетках имеется еще не менее двух центров образования фенолов [Запрометов, 1985]. Один из них связан с эндоплазматическим ретикулумом (место образования оксикоричных кислот, а также, вероятно, некоторых флавоноидов), а второй — с фракцией частиц, содержащих митохондрии и микротельца (образование я-оксибензойной кислоты). Автор приводит два основных пути биосинтеза фенольных соединений: через шикимовую кислоту (шикиматный) и ацетатно-малонатный. Установлено, что дезамини-рование фенилаланина и тирозина, осуществляемое амиак-лиазами, приводит к образованию коричной и я-оксикоричной (я-кумаровой) кислот соответственно. Из коричной кислоты при помощи гидроксилирующих (гидроксилаза коричной кислоты и полифенолоксидаза) и метилирующих (катехол-метилтрансфераза) ферментов далее образуются другие представители этой группы фенольных соединений [Запрометов и др., 1985].

До недавнего времени считалось, что высшие растения способны только синтезировать фенолы, а использование запасенной в них энергии — разрыв ароматических (бензольных) ядер — осуществляется в природе микроорганизмами. Оказалось, что это мнение ошибочно. В 1959 г. М. Н. Запрометов [1974] обнаружил, что введенные в побеги чайного листа растения 14С-катехины подвергаются глубокому окислению. После 60—70-часовой экспозиции в темноте до 80% радиоактивности введенных 14С-катехинов может быть обнаружено в составе углекислоты дыхания. Показано также, что гомогенаты листьев чая и виноградной лозы обладают особенностью расщеплять фенолы. У. В. Маргна и Л. Э. Лаанест [1980] пишут, что способность растений расщеплять циклические структуры фенолов до образования СОг и простых алифатических метаболитов, по-видимому, универсальна и проявляется в отношении большинства природных мономерных полифенолов. Авторы приводят ряд примеров декарбоксидярования экзо-и эндогенных фенольных соединений и подчеркивают, что метаболизм полифенолов, введенных в растение извне, существенным образом может отличаться от метаболизма этих же соединений в нормальных физиологических условиях.

В работе Гласса приведены данные о влиянии фенольных кислот на механизм поглощения ионов. Выяснено, что бензойные и коричные кислоты ингибируют поглощение ионов фосфора корнями ячменя [Glass, 1973]. Степень ингибирования хорошо коррелировала с растворимостью фенольных соединений в липидах. Это подтверждает гипотезу

43

ингибирования посредством изменения свойств мембран [Запрометов и др., 1985]. Работы о нарушении мембранного потенциала и проницаемости мембран под воздействием фенолов представляют интерес, так как обработка бензойной и коричной кислотами приводит к сильному снижению мембранного потенциала [Glass, Dunlop, 1974]. Фенолы способны связывать ионы тяжелых металлов в устойчивые хелатные комплексы, вызывая тем самым детоксикацию последних.

Фенольные соединения проявляют и антиоксидантное действие, которое объясняется двумя обстоятельствами: а) фенолы связывают ионы тяжелых металлов в устойчивые комплексы, тем самым лишая их каталитического действия; б) они служат акцепторами образующихся при аутоксидации свободных радикалов и поэтому способны "гасить цепные свободнорадикальные процессы. Окисление лишь одного фе-нольного соединения может привести к серьезному нарушению деятельности многих ферментных систем.

Способность фенолов к взаимодействию с белками является одним из важнейших свойств этих соединений. Они могут образовывать водородные связи с ггеггтидными группировками белковой молекулы, причем связь осуществляется между фенольной оксигруппой и карбонильным кислородом. Еще в 1929 г. А. И. Опарин и А. Л. Курсанов установили, что в присутствии полифенолов происходит инактивация ряда ферментов [Курсанов, 1952]. Особенно энергично взаимодействуют с белками хинонные формы фенолов. Хиноны, вступая во взаимодействие с тио-, амино- и другими группами белков, могут вызвать их дубление. При работе со срезами клубней картофеля показано, что некоторые фенольные соединения (гесперидин, нарингенин и их гликозиды, а также фло-ризин) тормозят синтез белков. Однако салициловая, о-кумаровая н я-оксибензойная кислоты гипокотилей конских бобов могут стимулировать синтез белка на 30—50% [Запрометов, 1974].

Биологическое действие фенольных соединений в клетке обусловлено строением их молекул и физико-химическими свойствами. Это, 'во-первых, способность к легкой ступенчатой отдаче электронов, во-вторых, наличие фенольных гидроксильных групп, которые являются весьма реакционноспособными [Барабой, 1984]. Такая активность играет важную роль при заражении патогенами. В инфицированных растениях активированный кислород может быть посредником в противо-инфекционном действии растительных фенолов, так как некоторые из них способны генерировать супероксидные радикалы [Аверьянов, Лапикова, 1984; Аверьянов, Исмаилов, 1986]. Исследователями выяснено участие этих радикалов в механизме токсического действия фенольных соединений и приведены сведения о том, что радикалы кислорода способны выступать как факторы фитоиммунитета. Известно, что фенольным соединениям свойственно гасить це