|
|
Современная генетика. Том 2зработан для дрозофилы, большие политенные хромосомы которой, несущие много копий каждого гена, значительно облегчали этот процесс. С середины семидесятых годов методы гибридизации in situ были распространены на геном человека. Первоначально этот метод использовали для картирования тандемных повторяющихся последовательностей ДНК, например для генов рибо-сомной РНК. В последнее время гибридизацию in situ удалось применить и для картирования уникальных генов человека. Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т. п. н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный (3Н) с помощью ник-трансляции. Пред метные стекла с метафазными хромосомами инкубировали с зондом в течение 16 часов, затем удаляли избыток меченой ДНК, не связавшейся с денатурированной ДНК метафазных хромосом. Распределение ги-бридизующихся зон на хромосомах выявляли методом радиоавтографии. Таким образом, в рассматриваемом случае было найдено, что искомая последовательность расположена в теломерной области короткого плеча хромосомы 1, в полосе 1р36 (рис. 18.19). Часто при гибридизации к меченому зонду добавляют большой избыток (тысячекратный) немеченой конкурирующей ДНК (табл. 18.5). Этот прием уменьшает неспецифическое связывание зонда. В рассматриваемом примере в отсутствие конкурирующей ДНК (второй ряд табл. 18.5) в большей части клеток гибридизация с фрагментом 14,9 т.п.н. происходит в области 1р36, однако значительная часть черных точек на автографе, означающих гибридизацию, оказывается распределена и по многим другим хромосомным локусам. В этом случае могут выявляться последовательности человеческой ДНК, гибридизующиеся с зондом менее специфично. В таблице 18,6 приведены гены человека, картированные с помощью гибридизации in situ. Генетическая карта человека Достоверно идентифицировано около 1500 генов человека. Это составляет 1-5% от их общего числа. Существование этих генов в большинстве случаев подтверждено обнаружением альтернативных аллельных форм. Для приблизительно 1000 известных генов один из альтернативных аллелей соответствует какому-либо заболеванию или аномалии. Другие известные гены кодируют белки группы крови, различные антигены, иммуноглобулины, ферменты и т.д. В течение долгих лет картирование человеческого генома продвигалось очень медленно. Появление методов генетики соматических клеток положило начало новой эры. Дополнительное ускорение в решении этой задачи было достигнуто благодаря применению генно-инженерных подходов. В настоящее время не существует принципиальных технических препятствий для получения полной карты генома человека. Однако вследствие огромного размера изучаемой ДНК этот процесс, конечно, займет многие годы. Установление функции всех последовательностей и понимание принципов организации генома видится в отдаленном будущем (см. табл. 18.7). Более 500 генов распределено по конкретным аутосомам. В каждой хромосоме, включая Y-хромосому, локализовано не менее 3 генов. Более 100 генов идентифицировано в Х-хромосоме и более 30 в больших хромосомах 1-6. На рис. 18.20 приведены все хромосомы человека и указана локализация некоторых генов. Перечень генов, локализованных в хромосоме 1, дан в таблице 18.8. Эта хромосома-самая крупная и самая изученная в геноме человека. В ее составе обнаружены гены, кодирующие белки различных классов. Это и ферменты, и белки группы крови, и факторы свертываемости крови. Мутации в некоторых из этих генов вызывают характерные генетические заболевания. Ряд генов связан с образованием легкотестируемых молекулярных маркеров. Определено значительное число последовательностей ДНК генов первой хромосомы. В популяциях людей отмечен полиморфизм генов этой хромосомы, хотя в ряде случаев его проявление существенно ограничено. Некоторые из генов хромосомы 1 можно тестировать у отдельных индивидуумов и, таким образом, использовать для генетического семейного анализа. Это гены AMY, GDH, PGD, PGM1, Rh U MP К. Другие гены, такие, как АК2, D1S1, ENOl, FH, FUCA, GALE, РЕРС, PGD, PGM1, UMPK, эффективно используются в генетике соматических клеток. Степень разрешения, достигаемая при картировании, определяется используемыми методами. Наиболее современные методы окрашивания позволяли выявить до 1000 полос на всех 23 хромосомах человека. В среднем на хромосому при этом приходится 50 полос, хотя на некоторых хромосомах их можно обнаружить в несколько раз больше, чем на других (сравни хромосомы 1 и 22 в табл. 18.9). Гаплоидный геном человека состоит из 3 109 п.н. Каждая полоса содержит 3-106 п.н., что соответствует нескольким сотням генов. Таким образом, пределом разрешения картирования с привлечением цитогенетических методов являются расстояния, соответствующие сотням генов. Величина генома человека, выраженная в единицах рекомбинации, составляет 3000 сантиморган (сМ), то есть 130 сМ в среднем на хромоТаблица 18.7. Типы генетических маркеров, используемые в различных методах картирования генов человека Классический семейный анализ Генетика соматических клеток Гибридизация in situ и сортировка хромосом Антигены групп крови (ABO, Rh); гены, связанные с раковыми заболеваниями (ретинобластома); хромосомные маркеры (деспирали-зованные участки, делеции); факторы свертываемости крови (фактор XII); клонированные гены (инсулин); компоненты системы комплемента; маркеры стадий развития (фетальный гемоглобин); заболевания неизвестной природы (синдром Прадера-Вилли); полиморфизм ДНК; фрагменты ДНК (неиденти-фицированные); ферменты (адено-зиндезаминаза, эстераза D); маркеры гистосовместимости (HLA); метаболические нарушения (фенилке-тонурия); морфологические признаки (дерматоглифика); митохонд-риальные маркеры (ядерная глю-таматоксалацетаттрансаминаза-М); сывороточные белки (альбумин, гаптоглобин); признаки, сцепленные с полом (дальтонизм, дефект по GPD) Активаторы (активатор плазми-ногена); маркеры культур клеток (промотор поликароцитози-са, температурочувствительные маркеры, транспортные мутации); клеточные рецепторы (рецептор эпидермического фактора роста); белки хромосом (гис-тоны); клонированные гены (НВВ, РОС, GH); цитоплазма-тические белки (маркеры двумерного электрофореза); полиморфизм ДНК; фрагменты ДНК (неидентифицированные); чувствительность к лекарственным средствам; ферменты (лактатде-гидрогеназа А); маркеры, влияющие на экспрессию генов; гормоны (PRL, CSH); иммуноглобулины; мембранные белки (поверхностные антигены); мито-хондральные маркеры (ядерная супероксиддисмутаза-2); модификаторы (белок, связующийся с аденозиндезаминазой; маркеры ауксотрофности (ген, ком-плементирующий отсутствие Ghy); маркеры органелл (лизо-сомные ферменты); рРНК; тРНК; повторяющиеся последовательности ДНК (DXZ1, сател-литная ДНК); рибосомные белки; видоспецифичные антигены; структурные белки (коллаген); чувствительность к токсину (дифтерийный токсин); маркеры, связанные с вирусами (чувствительность к коронавирусам) Клонированные гены {GH, INS, НВА); полиморфизм ДНК; фрагменты ДНК (неидентифицированные) ; рРНК По Shows Т. В. et al. (1982). Adv. Human Genet., 12, 341-452. сому. Один сантиморган соответствует приблизительно 106 п.н. (3-109 п. н.: 3000 сМ = 106 п.н./сМ). Таким образом, одна полоса, выявленная при окрашивании хромосом, соответствует 3 сМ. Генно-инженерные методы обеспечивают значительно более высокое разрешение. Применяя эти методы, можно картировать последовательности ДНК протяженностью от нескольких десятков пар нуклеотидов до 100 т.п.н. (Например, изученный район, содержащий глобиновые гены, имеет размер 60 т.п.н.) Последовательность ДНК в 100 т.п.н. соответствует примерно 0,03 от величины полосы окрашивания или 0,1 сМ. До сих пор не существует методов, позволяющих заполнить пробел между картированием в пределах 0,1 сМ, осуществляемым генно-инженерными методами, и картированием на участках величиной от 3 сМ, осуществляемым цитогенетически. Rh Sc Rd АК2 UMPK C8B PGM1 AMY 142 EL2 Ш AT3 UGPP1 GUK1&2 PEPC ji-FH J A12M1A3 TJRN5S NGF ALD2 RP1 RNUl NRAS Do GDH A12M2 ENOI PGD NB EL1 GALE .FUCA1 MA ?MTR SDH GBA PKFM SK XPAC ASG ASi" 53 a i i a. cot AKE AN1 ACPI POMC MDH1 АНН GLA1 'dak Ifs IGAS RACH GRS ADCP2 UGP2 IDH1 RPE FN IF1 (many) PRL INSL ASSP HAF ASD2 MRBC 1>мнсн SPC IDDM MDI GL01 ME1 SCA1 SOD2 PGM3 PDB PLA BEVI LAP PG SS ADCP1 MYB KRAS1 CGA ? HFE HLA-A MLRW HLA-C HLA-B IHG ITG IPHEG IGAT C2 C4F C4S C4BP NEU1 BF CAH1 C3BR C3DR HLA-D/DR H LA-DC H LA-SB IS PLTI RWS NDF RNTMI . FEA GCFl GCTG ASNS S7 EGFR /45Z. PSP GCPS _ BLVR 1 UP HADH MDH2 GUS8 COL1A2 COL3A1 NHCP1 L FG DIA2 NM СЛ4 TRPl ERBB GHS HI H2A H2B H3 LH4 , TG ]-GSR FN CF7E $h SPH CA2 J>MOS f-LTMYC HLnlpi RNR CKBB NP SPH1 r-WARS TRC Ml 95 Г PI D14S1* ESAT PFGS PGFT GLY В LlGH— VH(~250) D (many CD CG4 CG2 CG3 CGI CE1 CE2 CA1 LCA2 r-RNR GANC J BV1N J SORD _rPWS CVS DLXI MANA "P-HEXA J U-TB2M MP1 ,,PKM2 LIDH2 15 lpES 9%* ACM A 19 MANB GPI PEPD X.DNL CB3S PVS E11S M7VS1 BCT2 GUSM HC C3 Le DM NF Se Lu Hh APOE FEN CGB LHB, FSHB, TSHB P 1 DCE \_rMEN2 *-* ITPA SRC , SAHH J^-ADA 20 Рис. 18.20. Генетическая карта человека. Центромера и концы каждой хромосомы отмечены горизонтальными линиями. Гены хромосомы 1 приведены в табл. 18.8. (Courtesy of Prof. V. A. McKusic.) Р 1 V.it DHFR PEPS FUCA2 PLG PPAT DGIl DHPR ALB AFP MN Ss TVS Sf ASMD RGS FGA FGB FGC LAG5 P 1 IF2 DHFRLARS AVRR ARSB HEXB BAR LDLR GCTR MAR l-DTS FMS EMTBCHR 21 ASS WS1 EXT ORM ALADH AK1 DBH |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 |
Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |