ация G-типа пары хромосом 1 на стадиях 400, 550, 850, 1000 и 1200 полос. (Courtesy Jorge I. Younis of Minnesota.)

Внутрихромосомное картирование генов с помощью хромосомных перестроек

Идентификация индивидуальной хромосомы, в которой находится исследуемый ген,-это только первый этап картирования. Основной задачей являются установление порядка генов и их точная локализация. В некоторых случаях метод анализа родословных позволяет расположить на генетической карте хромосомы три и более маркеров. Использование более эффективных методов генетики соматических клеток может дать более точную информацию. Существенную помощь в таких исследованиях оказывают хромосомные перестройки (см. гл. 21). Далее мы рассмотрим примеры использования делеции, транслокаций или дупликаций для картирования генов.

Ген, кодирующий кислую фосфатазу 1 (ACPI) эритроцитов, расположен на второй хромосоме. При цитологическом изучении кариотипов двух детей (из двух разных семей), которые обладали множественными врожденными аномалиями, удалось показать наличие делеции терминальной области короткого плеча второй хромосомы. У одного из детей делеция хромосомы начиналась с терминального района полосы 2р23 (рис. 18.7). Культура клеток, полученных от этого ребенка, обладала ACPI-активностью. Эти клетки несли аллель А в одной из гомологичных хромосом и аллель В в другой. У второго ребенка делеция захватывала и проксимальный район полосы 2рЗЗ. Клетки, содержащие такую хромосому, были лишены активности этого фермента. Таким образом, можно заключить, что ген ACPI локализован в полосе 2р23 (рис. 18.8).

У культивируемых клеток часто обнаруживаются хромосомные перестройки, отсутствующие у индивидуумов, которые служили донорами исходных клеток. В других случаях перестройки, например транслоДелеция {21

Рис. 18.7. Вторая хромосома ребенка, несущая делецию терминального фрагмента короткого плеча. Сплошная стрелка указывает положение центромеры. Пунктирная стрелка-место разрыва в полосе 2р23. В эритроцитах этого ребенка присутствует фосфатаза 1 (По Emmanuel В. S. et al., 1979. Am. J. Med. Genet., 4, 167-172.)

А

14

Хр

14/Х

Рис. 18.9. Транслокация между хромосомами человека X и 14. А. Две нормальные хромосомы. Б. Транслоцированные хромосомы. (По RuddeF.H., Creagan R.P., 1975. Annu. Rev. Genet., 9, 407-486.)

кации, уже присутствуют в мутантных организмах. На рис. 18.9 изображена транс локация, произошедшая между хромосомой 14 и Х-хромосо-мой. Эта транслокация была исследована цитологическими методами. В гибридной линии клеток произошла утрата всех человеческих хромосом. Сохранилась только хромосома 14, несущая транслоцированное длинное плечо Х-хромосомы. У этих клеток обнаруживается экспрессия трех генов, локализованных в Х-хромосоме. Это HPRT, кодирующий фос-форибозил-гипоксантин—трансферазу, PGK, кодирующий фосфоглице-раткиназу, и G6PD, кодирующий глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназу. Таким образом, если транслоцированный сегмент хромосомы начинается с полосы Xql2, то можно считать, что все три гена располагаются между этой полосой и терминальной областью. В этой же клеточной линии показана экспрессия аутосомного гена, кодирующего нуклеозидфос-фотрансферазу (NP) и локализованного, таким образом, в составе четырнадцатой хромосомы. Обнаружение двух дополнительных транслокаций, в которые были вовлечены более короткие фрагменты Х-хромосомы, позволило определить порядок изучаемых генов. Этот порядок -HPRT—PGK—G6PD-& направлении к терминальной области Xq.

Изменение уровня накопления фермента может помочь картировать соответствующий дуплицированный ген. Ген GOT1, кодирующий растворимую глутамат-оксалацетат—трансаминазу, расположен в хромосоме 10. Как показано на рис. 18.10, были идентифицированы две клеточные линии, у которых фрагмент хромосомы 10 был транслоцирован на хромосому 17 или 21. Кроме того, у исследуемых клеток была сохранена и исходная хромосома 10. Линия с транслокацией 10/21 характеризуется уровнем активности GOT, сравнимым с таковым в контрольной

Хромосома

1

10 С

10 С

17 С

21 21

17 С

17 С

17 С

10/17 17

21 21

Наблюдаемая активность фермента

14,7+4

19,2±5

28,8±8

Ожидаемая активность фермента

17

Два'

сют локуса

17

Два GOT локуса

25,5

Три GOT локуса

Рис. 18.10. Хромосомный состав трех клеточных линий. Ожидаемая ферментативная активность в линиях, изображенных в левом и среднем столбцах совпала со средними экспериментальными значениями. У линии,

изображенной в правом столбце, уровень активности превышал значения, полученные для других линий на 50%. На этом основании можно предположить, что данная клеточная линия содержит три гена GOT.

линии, которая имеет две нормальные хромосомы и не имеет дуплици-рованных сегментов. Линия с транслокацией 10/17 характеризуется уровнем активности GOT, примерно на 50% большим, чем у других линий. Вот почему предполагают, что линия с транслокацией 10/17 содержит три копии гена GOT. Этот ген должен быть локализован на сегменте хромосомы 10, присутствующем в транслокации 10/17, но не 10/21 (рис. 18.11).

Рис. 18.11. Расположение гена GOT в полосе 10q24.3 десятой хромосомы. Места разрыва при транслокациях показаны стрелками. Верхняя стрелка указывает место транслокации 10/17, а нижняя-10/21 (см. рис. 18.10). Локус GOT расположен между этими двумя точками разрыва.

Микроклетки и изолированные хромосомы

Селекция по типу HAT и другие способы позволяют получать стабильные клеточные линии, несущие индивидуальные человеческие хромосомы. Существуют более прямые методы, позволяющие получать гибридные клеточные линии, содержащие определенные компоненты генома человека. Это гибридизация клеток мыши с микроклетками человека, несущими неполный геном, и эндоцитоз мышиными клетками изолированных хромосом человека.

Микроклетки представляют собой хромосомы, окруженные участками ядерной и плазматической мембран. При росте клеток в присутствии колцемида через несколько дней ядро распадается на несколько микронуклеусов, каждый из которых содержит только одну или несколько хромосом (рис. 18.12). Эти клетки обрабатывают цитохалази-ном и центрифугируют. Таким образом, отделяется фракция микроклеток, которые представляют собой микронуклеусы, окруженные тонким слоем цитоплазмы, заключенной между ядерной и плазматической мембранами. Цитологические методы позволяют определить, какие именно хромосомы содержат полученные микроклетки. Плазматическая мембрана сохраняет рецепторы для вируса Сендай, что позволяет проводить гибридизацию клеток мыши с полученными микроклетками, используя этот вирус. Образующиеся в результате гибридизации линии клеток несут определенные человеческие хромосомы. Гены человека, экспрессирующиеся в полученных гибридных линиях, могут быть, таким образом, отнесены к определенным хромосомам.

Препарат хромосом человека, не содержащий примеси клеток, может быть получен при соответствующей обработке, вскрывающей плазматическую и ядерную мембраны клетки. В семидесятых годах были разработаны методы фракционирования и проточной микрофлуоримет-рии, позволяющие осуществлять сортировку хромосом на фракции, содержащие индивидуальные хромосомы человека высокой чистоты (рис. 18.13). Когда свободные хромосомы добавляют к культивируемым клеткам мыши, то эти клетки могут захватывать целые хромосомы в процессе эндоцитоза. Внутри реципиентной клетки захваченные хромосомы обычно деградируют, распадаясь на фрагменты. Если такие фрагменты содержат центромерные области, то они могут поддерживаться как единое целое. Фрагменты, лишенные центромеры, могут транслоцироваться на мышиные хромосомы. В том и другом случае определенные человеческие гены будут экспрессироваться в гибридных клетках (рис. 18.14). Встраивание фрагментов в хромосому мыши происходит с очень низкими частотами, от 10" 4 до 10" 7 на клетку. Встраиваемые фрагменты могут быть как очень мелкими, не видимыми в световой микроскоп, так и достаточно крупными, включая плечи хромосом и даже целые хромосомы. Такой перенос генетического материала от донора, сопровождающийся встраиванием в хромосомы реципиента, называется трансформацией (как у бактерий) или трансфекцией.

Картирование генов в определенных областях хромосом может быть произведено в том случае, если экспрессию изучаемого гена можно тестировать в трансформированной клетке, а встроенный фрагмент хромосомы идентифицируется цитологически. При анализе трансфицироРис. 18.12. А. Клетки фибробластов человека, содержащие микронуклеусы. Б. Смесь клеток, микроклеток (яркие) и фрагментов цитоплазмы. В. Нуклеусы, включающие одну или несколько хромосом, окруженные тонким слоем цитоплазмы и плазматической мембраной. При фильтрации смеси, показанной на фото Б, через трехмикронный фильтр самые мелкие микроклетки вместе с небольшими фрагментами (В) цитоплазмы удается отделить от более крупных микроклеток и целых клеток. (По McNeil С. А., Brown R.L., 1980, PNAS, USA, 77, 5394-5398.)

Рис. 18.13. Распределение флуоресценции нормальных хромосом человека, полученное с помощью прибора, позволяющего разделить хромосомы на основе различий в уровне флуоресценции. Числа над пиками обозначают номера хромосом человека. Удается получить фракции, содержащие одну-две индивидуальные хромосомы. (По Zebo R. V. et al, 1979. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 76, 5804-5808.)

о 8

в

о

1,0

(19,21,22)

(9, 10, 11,12)

(16,18) I

1(7.8,*)

(5,6)

, ii!, И is)

\

Рис. 18.14, Впервые перенос генов с помощью целых хромосом был использован для встраивания генетического материала китайского хомячка в клетки мыши. На рисунке клетки мыши содержат дефект в гене HPRT. Трансформированные клетки мыши, выросшие на среде HAT, должны содержать ген HPRT хомячка. (По Klobutcher Z, Л., Ruddl F.H., 1981. Annu. Rev. Biochem., 50, 533-554.)

Хромосома реципиентной клетки

Образовавшиеся хромосомы

/~Л ЛЛ Г~\

А-В Селектируемый

ген (SG)О

• ft

А- В-

SG

В- SG - С

SG - С - щ

С ~ ?

щ

Хромосома Клон Клон Клон

донорной клетки j 2 3

Рис. 18.15. Для картирования генов п