ентальные данные о процессах перегруппировки генов, кодирующих константные и вариабельные участки иммуноглобулиновых цепей, были получены с помощью методов, основанных на применении рекомбинантных ДНК. Для этого из фракции полисом выделяли мРНК, кодирующую L-цепь миеломы, на ее основе с помощью обратной транскриптазы получали кДНК, которую клонировали на плазмид-ном векторе. Наработанную в значительных количествах клонированную кДНК расщепляли подходящей рестриктазой таким образом, чтобы получить два фрагмента, соответствующих V- и С-участкам L-цепи. Фрагменты ДНК разделяли препаративно с помощью электрофореза, вводили радиоактивную метку с помощью ник-трансляции, денатурировали и использовали в качестве зондов для идентификации фрагментов рестрикции ДНК из миеломных или эмбриональных клеток, содержащих последовательности, комплементарные последовательностям зондов. Наиболее существенно, что, как показано на рис. 16.22, в ДНК клеток миеломы оба V- и С-кодирующих участка локализуются на одном и том же Есо RI-фрагменте, в то время как в эмбриональной ДНК они находятся на различных Есо RI-фрагментах. Это означает, что на каком-то этапе развития между эмбриональной клеткой и дифференцированным лимфоцитом происходит специфическая перестройка ДНК, которая в данном случае привела к удалению Есо RI-сайта (или сайтов), находившегося в рамках протяженной области ДНК между V- и С-ко-дирующим участками в эмбриональной ДНК. После такой перестройки эти участки оказались расположенными в непосредственной близости друг к другу. Комбинация генов L-цепи, возникшая при их перегруппировке в ходе дифференциации лимфоцита, при его последующем мито-тическом делении устойчиво наследуется дочерними клетками.

Общая организация группы генов L-цепи показана на рис. 16.23. Число генов V точно неизвестно и находится в диапазоне 200- 300. Каждый ген содержит примыкающую к структурной области промо-торную последовательность, однако не транскрибируется до тех пор, пока не произойдет продуктивная перестройка ДНК, соединяющая его с одним из пяти генов J. Гены Vu J разделяются короткими, одинаково организованными участками последовательности, которые содержат

Область ДНК, подлежащая делеций

RH- ДНК ЗАРОДЫШЕВОЙШ^Ч^ЧЕШ^*^^^^—ПН- 2^^™го

РГ)—-ffi*—-^~С"~\^. : ЯРНК.ТРЛНСКПИ

ЗРЕЛАЯ МРНК

Рис. 16.23. Организация семейств генов х легких цепей, расположенных в одной хромосоме. Единичная перестройка ДНК объединяет одного из представителей семейства генов (200-300 различных генов) с одним из пяти представителей семейства генов Ух.

Таким образом, возникает индивидуальная транскрипционная единица с промотором, примыкающим к гену V^, Соответствующая мРНК полипептидной цепи образуется при сплайсинге гяРНК-транскрипта.

Область ДНК, подлежащая делеции

?f

С„ - С,

чад—енш-Н>>2

"KSHHSj И" С< ~8" С"1 ~Ш^Э""" продуцирующего

IgM и IgD

'13Ш\— Ш- -в- -ЕЬ в- -Sчаи

ДНК лимфоцита, продуцирующего IgG3

гяРНК-траискрипт Зрелая Н,3-мРНК

Рис. 16.24. Организация семейств генов тяжелых цепей в ДНК единичной хромосомы. В результате двойной перестройки ДНК представитель семейства генов VH соединяется с одним из генов семейства D и с одним из генов семейства JH. Образуется транскрипционная единица, считываемая в виде гяРНК, содержащей участки VHDJH, а также участки Сц и С6. При альтернативном сплайсинге такого транскрипта могут возникать мРНК, кодирующие Яц- и Я5-цепи. Третья перестройка ДНК, включающая рекомбинацию по сайтам переключения классов (помечены серым), приводит к тому, что данный В-лимфоцит начинает продуцировать иммуноглобулины определенного класса. При этом тот же самый участок VHDJH, который исходно примыкал к участку Сц, объединяется с одним из представителей семейства Сн (в данном случае с геном Су3).

7 консервативных п.н. с одной стороны и 9-с другой, разделенных последовательностью из 12 п.н. Считают, что эти участки последовательности принимают участие в перестройке ДНК, приводящей к делеций области хромосомы, расположенной между двумя объединяемыми генами Ки J. В сформировавшейся ДНК дифференцированного лимфоцита транскрипция инициируется на промоторе гена V и продолжается до гена С включительно. В ходе сплайсинга РНК-транскрипта удаляются все J-участки, кроме того, который непосредственно примыкает к гену V. Таким образом, формируется мРНК, в которой последовательно соединены по одной копии генов К J и С.

На рис. 16.24 показана общая организация группы генов Н-цепи. Семейства генов JJJ, D, и VH расположены перед семейством генов СН. Каждый из генов VH содержит собственную промоторную последовательность. Выбор экспрессии данного V-участка тяжелой цепи сопровождается двумя перегруппировками генов в ДНК: объединением генов VH и D с удалением промежуточной области ДНК и объединением VflD и Jfj, также с удалением промежуточной последовательности. Таким образом, возникает транскрипционная единица, с которой за счет альтернативного сплайсинга могут считываться ц- и 5-варианты тяжелой цепи данного типа. В сочетании с продуктами экспрессии образовавшихся транскрипционных единиц типа Lx или Lx экспрессия генов Яц и Нъ обеспечивает продукцию IgM и IgD. В дальнейшем на стадии терминальной дифференцировке В-лимфоцитов происходит так называемое переключение классов, которое настраивает клетку на продукцию того или иного из перечисленных в табл. 16.5 класса иммуноглобулинов. Это переключение сопряжено с третьей перестройкой ДНК, в ходе которой экспрессируемая область VHDJH объединяется с определенным Сн-участком, при этом удаляется промежуточная область ДНК. Каким образом в В-лимфоцитах происходит регуляция таких сложных перестроек ДНК, пока неизвестно.

Заключение

Выявление множества разнообразных процессов, вовлеченных в регуляцию экспрессии эукариотических генов, свидетельствует о том, что эта регуляция осуществляется на целом ряде различных уровней. Как видно из приведенных в настоящей главе примеров, многое уже известно о регуляторных центрах в ДНК. Эти знания основаны на структурной информации, полученной с применением рекомбинантных ДНК. В то же время многие аспекты регуляции генов у эукариот остаются неясными. Относительно мало известно о регуляторных молекулах, которые должны взаимодействовать с регуляторными центрами ДНК, а также об эффекторах, оказывающих модуляторное действие на функционирование регуляторных молекул в отношении экспрессии тех или иных генов. Ясно, что многие важнейшие детали регуляции экспрессии эукариотических генов на молекулярном уровне подлежат дальнейшему изучению.

AmaraS.G. et al. (1982). Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products, Nature, 298, 240-244.

Birchmeier C, Grosscheld R., Bernstiel M. L. (1982). Generation of authentic 3' termini of an H2A mRNA in vitro is dependent on a short inverted DNA repeat and on spacer sequences, Cell, 28, 739-745.

Borst P., Cross G. A. M. (1982). Molecular basis for trypanosome antigenic variation, Cell, 29, 291-303.

Brack C. et al. (1978). A complete immunoglobulin gene is created by somatic recombination, Cell, 15, 1-14.

Cordon J. et al. (1980). Promoter sequences of eukaryotic proteincoding genes, Science, 209, 1406-1414.

Darnell J. E., Jr. (1982). Variety in level of gene control in eukaryotic cells, Nature, 297, 365-371.

Davidson E.H., Jacobs H. Т., Britten R.J. (1983). Very short repeats and coordinate induction of genes, Nature, 301, 468-470.

Early P. et al. (1980). An immunoglobulin heavy chain variable region gene is generated from three segments of DNA: VH, D and JH, Cell, 19, 981-992.

Early P., Hood L (1981). Allelic exclusion and nonproductive immunoglobulin gene rearrangements, Cell, 24, 1-3.

Elgin S. C.R. (1981). DNase I-hypersensitive sites of chromatin, Cell, 27, 413-415.

Harland R. M., Weintraub H., McKnight S. L. (1983). Transcription of DNA injected into Xenopus oocytes is influenced by template topology, Nature, 302, 38-43.

Hood L.E., Weissman I.L., Wood W. В., 1978. Immunology, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif.

Lerner M.R. et al. (1980). Are snRNPs involved in splicing? Nature 283, 220-224.

McGinnis W. et al. (1983). DNA sequence changes in an upstream DNase I-hypersensitive region are correlated with reduced gene expreession,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1063-1067.

McKnight S.L. (1982). Functional relationship between transcriptional control signals of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus, Cell, 31, 355-365.

McKnight S.L, Kingsbury R. (1982).

Transcriptional control signals of a eukaryotic proteincoding gene, Science, 217, 316-324.

Marcu K.B. (1982). Immunoglobulin heavy-chain constant-region genes, Cell, 29, 719-721.

Nasmyth K.A. (1982). Molecular genetics of yeast mating type, Annu. Rev. Genet., 16, 439-500.

Ohshima Y et al. (1981). Novel models for RNA splicing that involve a small nuclear RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4471-4474.

Proudfoot N.J., Brownlee G.G. (1976). 3' non-coding region sequences in eukaryotic messenger RNA, Nature, 263, 211-214.

Razin A., Riggs A.D. (1980). DNA methylation and gene function, Science, 210, 604-610.

RozekC.E., Davidson N. (1983). Drosophila has one myosin heavy-chain gene with three developmentally regulated transcripts, Cell, 32, 23-34.

Sharp P. A. (1981). Speculation on RNA splicing, Cell, 23, 643-646.

Shermoen A.W., Beckendorf S. K. (1982). A complex of interacting DNase I hypersensitive sites near the Drosophila glue protein gene, Sgs4, Cell, 29, 601-607.

Strathern J.N., Herskowitz 1. (1979). Asymmetry and directionality in production of new cell types during clonal growth: the switching pattern of homothallic yeast, Cell, 17, 371-381.

Vardimon L. et al. (1982). Expression of a cloned adenovirus gene is inhibited by in vitro methylation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1073-1077.

Weisbrod S. (1982). Active chromatin, Nature, 297, 289-295.

Yang V.W. et al. (1981). A small nuclear ribonucleoprotein is required for splicing of adenoviral ea