Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

93 по 131 остаток образует перемычку между двумя функциональными доменами, на которой расположен участок атаки протеиназы RecA. В активной форме белок cl представляет собой димер, структура которого поддерживается нековалентными взаимодействиями между С-концевыми доменами двух субъединиц. Оба N-KOH-цевых домена связываются кооперативно с палиндромными последовательностями каждого из трех участков 0R1, 0R2 и 0R3. При индукции протеиназа RecA расщепляет полипептидную цепь на участке между доменами. В результате этого нарушается кооперативность связывания, что проявляется в значительном снижении сродства индивидуальных N-концевых доменов к центрам связывания в операторной области.

Связывание очищенного димера cl с изолированной ДНК 0R изучали с помощью метода «футпринтинга». Таким образом удалось оценить относительные

Appp

NH2

Рис. 15.16. Последовательности ДНК, РНК и белков внутри и вокруг операторной области Ок фага X. Отмечены три участка связывания репрессора. Показаны точки инициации транскрипции генов сто и cl. Звездочками помечены шесть оснований на участке ORJ, которые в структуре транскрипта гена cl, вероятно, используются для прочного связывания с рибосомой. (По Ptashne М. et al., 1980. Cell. 19, 1.)

Рис. 15.17. Специфичность связывания репрессора cl фага X с последовательностями 0R 1, 0R 2 и 0R 3, оцениваемая с помощью «футпринтин-га» (см. Дополнение 14.2). Расщепление ДНКазой I рестрик-ционных фрагментов, содержащих область 0R и меченых 32 Р. Расщепление проводили в присутствии возрастающих концентраций репрессора. Концентрация репрессора дана в единицах мо-лярности (нМ) в расчете на 1 субъединицу репрессора. (Courtesy of A. D. Johnson, B.J. Meyer, M. Ptashne, Biological Laboratories, Harvard University.)

значения концентрации cl, при которых каждый из трех центров связывания белка защищается от действия ДНКазы I. Как показано на рис. 15.17, при низких концентрациях cl приблизительно в равной степени защищаются участки 0R1 и 0R2. Для защиты участка 0R3 необходима значительно более высокая концентрация белка cl. В таблице 15.3 приведены относительные значения концентрации cl, при которых для каждого из участков связывания наблюдается защита половины операторов от действия ДНКазы,

Аналогичные опыты были поставлены с очищенным N-концевым доменом cl, полученным с помощью ограниченного про-теолиза. Обратите внимание на данные, представленные в таблице 15.3, которые свидетельствуют о том, что для изолированного N-концевого домена в отличие от нативного белка наблюдается сильное сродство к участку 0R1 и приблизительно одинаковое, более слабое сродство к обоим участкам 0R2 и 0R3. Наблюдаемые различия в поведении белка по отношению к участку 0R2 указывают на возможТаблица 15.3. Относительные концентрации белков, необходимые для защиты различных участков области 0R от расщепления ДНКазой I

Белок Or3 Or2 Or1

cl (нативный димер) 25 2 1

cl (N-концевой домен) 82500 82 500 3 300

Сго 18 8

По Johnson А. В., Meyer В., Ptashne М. (1979). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 5061.

ное участие С-концевых доменов нативно-го белка cl в обеспечении кооперативного связывания димеров с 0R1 и ОК2, Такая кооперативность, вероятно, играет важную роль в поддержании репрессии профага. Как известно, связывание белка cl с оператором ОК предотвращает инициацию транскрипции с промотора PR, но не мешает транскрипции с PRm, благодаря которой поддерживается необходимый уровень синтеза самого белка cl. Моделирование процессов связывания дает основания предполагать, что в результате связывания димеров cl с участками 0R1 и ОК2 один из N-концевых доменов белка на участке 0R2 может контактировать с РНК-полимеразой, связанной с PRM (рис. 15.18). Не исключено, что такой контакт может оказаться необходимым для образования открытого комплекса между полимеразой и PRM. В этом случае белок cl будет выступать в роли позитивного регулятора транскрипции с РШ. Обнаружены мутации, изменяющие отдельные аминокислотные остатки в N-концевом домене белка cl, которые не сказывались на способности белка связываться с ДНК, но подавляли его способность к активации транскрипции с PRM. Структурные исследования белка cl показали, что эти аминокислотные остатки действительно расположены в области возможных контактов с РНК-полимеразой (рис. 15.18). Таким образом, при связывании с 0R1 и 0R2 белок cl стимулирует дальнейшую наработку этого белка. В то же время при высоких концентрациях cl он может связываться также и с участком 0R3 (см. табл. 15.3), что приводит к подавлению транскрипции с PRM. Следовательно, белок cl, изначально получивший название А,-репрессора, в действительности может играть как позитивную, так и негативную роль в регуляции своего собственного синтеза и в то же время служить негативным регулятором транскрипции с промотора PR.

Эксперименты по защите от расщепления ДНК в присутствии белка Сго показали, что этот димерный белок при низких концентрациях связывается преимущественно с ОКЗ, а при высоких концентрациях может связываться также с ОК2 и

0R1, не проявляя кооперативности в связывании димеров с соседними центрами связывания (см. табл. 15.3). Это позволяет считать, что в физиологических условиях in vivo белок Сго связывается только с 0R3, блокируя транскрипцию с Рцм> но не препятствуя инициации транскрипции с промотора PR. Таким образом, альтернативная транскрипция с промоторов PR или PRM контролируется относительным содержанием белков Сго и cl и особенностями их специфического взаимодействия с центрами связывания в области 0R.

Молекулярные основы узнавания регу-ляторными белками определенных участков ДНК удалось во многом прояснить благодаря кристаллизации и рентгено-структурному анализу трех важнейших белков-регуляторов: белка Сго, ДНК-связывающего домена белка cl и САРбелка Е. coli. Несмотря на совершенно различные аминокислотные последовательности, эти белки обладают очень схожей вторичной и третичной структурой на участках, ответственных за связывание с ДНК. В каждом из этих белков имеются два соседних ос-спиральных участка, расположенные в пространстве один над другим и образующие область структуры, непосредственно связывающуюся с ДНК. Часть этой структурной области точно входит в большую бороздку В-формы ДНК.

Относительное расположение аминокислотных остатков, образующих вышеупомянутые а-спирали в белках Сго и cl, показано на рис. 15.19, А. Положение этих а-спиралей в общей пространственной структуре белков показано на рис. 15.19, Б. Аминокислотные остатки вблизи N-концов обеих а-спиралей образуют конРис. 15.19. Регуля-торные белки, связывающиеся с ДНК, обладают общими структурными особенностями. А. Вторичная структура белка его и субъединицы репрессора cl характеризуются наличием пары одинаково расположенных а-спиральных участков (ос2 и <хЗ). Б. Ориентация пары а-спиралей обеспечивает точное структурное соответствие размерам и форме большой бороздки двойной спирали ДНК, где происходит специфическое взаимодействие определенных оснований и аминокислотных остатков. Таким образом, достигается специфичность связывания белка с определенной последовательностью ДНК. (По Saner R. Т. et al, 1982. Nature 298, 447.)

al

X его

a4

01 al al аЗ 02 03

aS

такты с основаниями узнаваемой последовательности ДНК, расположенными внутри большой бороздки двойной спирали. В структуре ос-спиралей боковые группы аминокислот ориентированы наружу, что дает основания считать, что специфичность взаимодействия обусловлена контактами аминокислотных остатков различных белков с разными нуклеотидами соответствующих участков ДНК. Таким образом, на основе общей структурной основы ДНК-белкового узнавания различные аминокислотные последовательности могут специфически взаимодействовать с различными нуклеотидными последовательностями.

Сравнение аминокислотных последовательностей ряда других регуляторных белков, таких, как lac-репрессор, белок ell фага X, а также аналоги белков Сго и cl фагов 434 и Р22, показало, что все они обладают такой же а-спиральной организацией соответствующих участков структуры. Таким образом, использование пары а-спиралей для специфического связывания с ДНК является, вероятно, общей особенностью механизмов ДНК-белкового узнавания.

Опероны биосинтеза аминокислот

При обсуждении регуляции фага X мы видели, что контроль транскрипции некоторых генов может осуществляться с помощью позитивной регуляции, основанной на антитерминации. Белки N и Q действуют на РНК-полимеразу таким образом, что она оказывается способной продолжать транскрипцию, минуя определенные терминаторные последовательности, которые в отсутствие этих белков останавливают транскрипцию. Регуляция экспрессии генов с помощью антитерминации также является характерной особенностью функционирования бактериального генома. Наиболее интенсивно антитерминация была изучена на примере организации ряда оперонов биосинтеза аминокислот в нескольких видах бактерий. Эти исследования также значительно расширили наши представления о природе самого процесса терминации. Оказалось, что в этих оперонах антитерминация происходит при участии рибосом. Это открытие выявило тесную связь между процессами транскрипции и трансляции. Оно позволило объяснить, каким образом «onsense-мутации в полицистронных оперонах типа /ас-оперона могут привести к проявлению полярных эффекторов, а также предложить механизм антитерминационного действия белков N и Q. Триптофановый оперон (trp) E.coli включает пять генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза триптофана (рис. 15.20). Эти гены транскрибируются в виде полицистронной мРНК, синтез которой инициируется на промоторе, находящемся под контролем прилегающего операторного участка, подобно тому как это организовано в случае /ас-оперона. Транскрипция контролируется взаимодействием оператора и белка-репрессора, эффектором которого служит триптофан-конечный продукт пути биосинтеза, направляемого продуктами генов frp-оперона. При избытке триптофана он связывается со свободным репрессором и оказывает аллостерическое влияние на его структуру,

страница 40
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2019)