Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

p>Первые указания на то, что в системе репликации ДНК участвует целый ряд важных генетических функций, были получены благодаря выделению широкого набора условно-летальных температурочувстви-тельных мутантов Е. coli (dna ~), комплементационный анализ которых позволил соотнести их с мутациями в ряде различных генов. Среди них можно выделить два класса мутантов, которые при рестриктивной температуре: (1) немедленно прекращают синтез ДНК или (2) в течение относительно протяженного временного интервала постепенно прекращают синтезировать ДНК (рис. 13.5). Первый фенотип связан с нарушением процесса синтеза ДНК в репликативной вилке, а второй-с исчезновением способности инициировать новый цикл репликации хромосомы. (В несинхронизированной культуре индивидуальные клетки мутантов второго класса, находящиеся на различных стадиях репликации, начавшейся еще при пермиссивной температуре, не прекращают синтезировать ДНК после повышения температуры до полного завершения цикла репликации хромосомы.) После сопоставления выделенных мутаций с определенными белками, на которых сказываются эти мутации, можно начать изучение функциональной роли этих белков in vivo. Локализация генов, ответственных за репликацию ДНК, на хромосоме Е. coli показана на рис. 13.6.

Биохимический анализ репликации ДНК

В клетках Е. coli содержатся три различных фермента с ДНК-полиме-разной активностью. Среди них наиболее полно изучена представленная в клетке наибольшим числом молекул ДНК-полимераза I (Pol I). Этот фермент способен направлять синтез комплементарной цепи по матричной цепи ДНК при наличии соответствующей комплементарной затравочной цепи со свободной З'-ОН-группой, связанной водородными связями с матричной цепью. Полимеризация происходит в направлении 5' -? 3' за счет взаимодействия очередного дезоксирибонуклеозидтри-фосфата с З'-ОН группой растущей (затравочной) цепи. Фермент Pol I обладает также 5' -> З'-экзонуклеазной активностью, т.е. способен последовательно отщеплять 5'-нуклеотиды от цепи ДНК, связанной с матричной цепью. На рис. 13.7 изображена модель структуры ДНК-поли-меразы I с указанием расположения соответствующих функциональных центров. Особые ферментативные свойства ДНК-полимеразы I сделали этот фермент эффективным и весьма распространенным инструментом для изучения нуклеиновых кислот (см. Дополнение 13.1).

Фермент Pol I считали единственной ДНК-полимеразой Е. coli до тех пор, пока не была обнаружена мутация {polA), подавляющая эту по-лимеразную активность (не менее чем на 98%), однако не сказывающаяся существенно на способности мутантного штамма к размножению. Благодаря обнаружению мутантного штамма polA биохимикам удалось идентифицировать и выделить две другие ДНК-полимеразы, Pol II и Pol III, которые в обычных штаммах Е. coli вносят небольшой вклад в общую ДНК-полимеразную активность.

Дополнение 13.1. Применение ДНК-полимеразы I

ДНК-полимераза I (или Pol I) Е. coli находит широкое применение в работе с ре-комбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности ДНК. Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК in vitro с помощью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5' -> З'-экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е. получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки in vivo. Радиоактивные ДНК-зонды, полученные с помощью ник-трансляции, могут использоваться при скрининге библиотек рекомбинантных ДНК для обнаружения клонов, содержащих комплементарные последовательности ДНК, или для идентификации соответствующих фрагментов рестрикции ДНК после электрофоретического разделения в геле (см. гл. 9). В присутствии двухцепо-чечной ДНК, содержащей одноцепо-чечный разрыв фосфодиэфирной связи, и меченых дезоксирибонуклеозидтрифос-фатов ДНК-полимераза I направляет одновременно включение радиоактивных предшественников в растущую цепь и деградацию немеченой цепи ДНК (рис. 13.8). Двухцепочечную меченую ДНК затем денатурируют тепловой или щелочной обработкой и получают одно-цепочечный зонд.

Рис. 13.8. Синтез in vitro радиоактивной цепи ДНК (цветная линия) при действии ДНК-полимеразы I. Совместное действие полимеризационного и экзонуклеазного центров (см. рис. 13.7) приводит к перемещению одноцепочечного 3'-ОН/5'-Р04-разрыва вокруг показанной на рисунке кольцевой матричной цепи. Поэтому данный процесс называется ник-транс-ляцией (т.е. перемещением разрыва).

Poll dNTP

Pol I dNTP

Помимо этого ДНК-полимераза I является необходимым компонентом важнейшего метода определения последовательности ДНК, который называют «методом терминации цепи». Для установления последовательности ДНК, как обсуждалось в гл. 9, необходимо получить серии радиоактивно меченых перекрывающихся фрагментов, причем в рамках каждой серии все фрагменты должны начинаться с одной общей точки и статистически распределяться по длине таким образом, чтобы на противоположном конце каждого фрагмента находилось основание одного определенного (для данной серии) типа-А, Т, G или С. В этом методе серии перекрывающихся фрагментов получают с помощью ДНК-полимеразы I по одноцепочечной ДНК-матрице с использованием небольшого затравочного олигонуклеотида (праймера), комплементарного определенному участку матрицы, и радиоактивных дезоксирибонуклеозид-трифосфатов. Для каждой матрицы проводят четыре независимые реакции полимеризации, при этом каждый раз в реакционной смеси содержится некоторая доля одного из четырех оидезоксири-бонуклеозидтрифосфатов, встраивание которых вызывает терминацию роста цепи, что обусловлено отсутствием у встроившегося нуклеотида З'-ОН-группы, необходимой для осуществления следующего этапа элонгации. Например, в реакционной смеси, содержащей диде-зоксиаденозинтрифосфат и четыре дезок-сирибонуклеозидтрифосфата, в каждое положение растущей цепи, соответствующее остатку тимина в матричной цепи, будут конкурентно включаться и дезоксиа-денозин, и дидезоксиаденозин. В тех случаях, когда будет происходить включение дидезоксиаденозина, дальнейший рост цепи на данной матрице будет уже невозможен. При включении дезоксиаде-нозина полимеризация будет продолжаться без помех вплоть до следующего матричного остатка тимина, где вновь с некоторой вероятностью может произойти включение дидезоксиаденозина, приводящее к терминации цепи. Таким образом может быть получена серия всех

Клонирующий вектор М13 со вставочной последовательностью

Бляшки фага М13, несущего вставочную последовательность

Из отдельной бляшки получают культуру фага, выделяют фаговую одноцепочечную ДНК

Добавляют затравку, комплементарную последовательности М13, примыкающей к вставке

Р~Р—«р— о

то

он н

Радиоактивный dNTP

Pol I

Основание

,-,-,-„-^1

Нагревают для отделения наборов перекрывающихся фрагментов от матрицы. Фракционируют фрагменты с помощью электрофореза ^ /с

о

—... т

Рис. 13.9. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с помощью клонирования на фаге М13 и последующего использования метода терминации цепи с применением фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I. Сравните строение обычных де-зоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) и терминирующих дидезоксирибонуклеозид-трифосфатов (didNTP).

возможных перекрывающихся фрагментов, начинающихся с праймерного участка и статистически обрывающихся на З'-концевом остатке А.

Данный способ определения последовательности ДНК наиболее эффективно применяется для рестрикционных фрагментов ДНК, встроенных в двухцепочеч-ную репликативную форму клонирующего вектора, сконструированного на основе одноцепочечной ДНК фага М13. Выделение фаговых частиц, образующихся после трансфекции полученным таким образом двухцепочечным рекомбинантным фаговым геномом, служит непосредственным источником кольцевых одноце-почечных ДНК-матриц, которые используют для определения нуклеотидной последовательности. Описанный метод схематически изображен на рис. 13.9.

ДНК-полимеразу I, используемую для определения последовательности ДНК методом терминации цепи, определенным образом обрабатывают для того, чтобы избавиться от свойственной этому ферменту 5' -*? 3' экзонуклеазной активности. Активность этого типа может мешать осуществлению манипуляций, приведенных на рис. 13.9, атакуя 5'-конец праймера, используемого для инициации полимеризации. При обработке ДНК-полимеразы I протеиназой субтилизином, происходит расщепление фермента на два крупных полипептида, один из которых проявляет 5' -»• 3' экзонуклеазную активность, а другой содержит каталитический центр полимеризации. Последний фрагмент (известный как фрагмент Клёнова) сохраняет полимеразную активность и может быть полностью очищен от примеси 5' -* З'-экзонуклеазного фрагмента.

На первый взгляд казалось, что это наблюдение свидетельствует о функциональной заменимости ДНК-полимеразы I. Однако дальнейшие исследования показали, что мутация polA не затрагивает 5' -? ->• З'-экзонуклеазной активности Pol I. Удалось получить добавочные температурочувствительные мутации гена polA, подавляющие 5' -> -? З'-экзонуклеазную активность и летальные при рестриктивной температуре. На основании этих данных был сделан вывод о том, что 5' -? -? З'-экзонуклеазная активность Pol I является жизненно важной функцией, необходимой для удаления РНК-затравок при репликации, т.е. для обеспечения нормального синтеза полноценной отстающей цепи ДНК (рис. 13.3). В действительности для исходного роЫ-мутанта было показано, что фрагменты Оказаки встраиваются в протяженные участки цепи ДНК с некоторым запаздыванием, и это свидетельствовало о возможном участии ДНК-полимеразы I в заполнении пустот, возникающих после удаления РНК-затравок из отстающей цепи. В то же время эту функцию Poll нельзя назвать жизненно важной, поскольку в polA-мутантном штамме с ней вполне успешно справляется фермент Pol III.

Изучение штаммов, мутантных по гену

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.03.2019)