серповиднркдеточной анемии ((3 |3 ), определяли с помощью радиоактивного зонда. {Geever R. F. et al. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 5081.]

В

Pro-Glu-Glu CCT GAG GAG GGA СТС CTC

Pro - Val - Glu CCT GTG GAG GGA С AC CTC

Аминокислотная последовательность (кодоны 5, 6 и 7) и соответствующая нуклеотидная последовательность

iz a: 3. I

Сайт рестрикации Dde I подчеркнут

1L» *j I—I Hi

175

88

Q Q J Q

376

88

201

центраций, достаточно высоких для вакцинации. Разработка синтетических вакцин позволяет решить многие из этих проблем. Основным антигеном вируса ящура является белок головки вируса VP1. Однако сам по себе этот белок, выделенный в очищенном состоянии из вирусных частиц, или полученный из клеток Е. coli, используемых при клонировании гена VP1, обладает слабым антигенным действием и не может использоваться в качестве вакцины. Определение нуклеотидной последовательности клонируемого гена позволяет, зная генетический код (см. главу 12), легко определить полную последовательность аминокислот в белке VP1. После того как полная последовательность аминокислот известна, нетрудно химически синтезировать более короткие полипептиды, обладающие сильными антигенными свойствами и индуцирующими синтез антител против целых вирусных частиц.

Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, Е. coli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2ц-плазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2|д и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрожжевых клетках, так и в Е. coli. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может служить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (интерферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще).

Дрожжевые клетки наиболее подходят, по-видимому, для производства не содержащих вирусы вакцин против болезни человека, вызываемой вирусом гепатита В. Этот вирус состоит из нуклеопротеинового кора, содержащего геном вируса и окруженного фосфолипидной мембраной, поверхность которой составляют кодируемые геномом вируса белки. Антигенно активной составляющей является белок поверхности вируса, однако для сильной антигенной активности необходимо, чтобы этот белок входил в состав фосфолипидной мембраны. Мембранная система дрожжевых клеток аналогична системе других эукариотических организмов и отлична от мембранной системы Е. coli. Когда белок, кодируемый клонируемым геном вируса гепатита В, накапливается в дрожжевых клетках, то образуются фосфолипидные частицы с белковой поверхностью, которые способны индуцировать производство вакцинируемым организмом антител против вируса в целом. С другой стороны, при накоплении этого белка в клетках Е. coli он не связывается с фосфолипидами и поэтому не вызывает сильной антигенной реакции.

Применение методов рекомбинантных ДНК к фундаментальным генетическим исследованиям мы рассмотрим в различных главах второй части.

Литература

Abelson J. (1977). Recombinant DNA: examples of present-day research, Science, 196, 159-160.

Abelson J. (1980). A revolution in biology, Science, 209, 1319-1321.

Arber W. (1979). Promotion and limitation of genetic exchange, Science, 205, 361-365.

Berg P. (1981). Dissections and reconstructions of genes and chromosomes, Science, 213, 296-303.

BittleJ.L. et al. (1982). Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence, Nature, 298, 30-33.

Britten R., Kohne D. E. (1968). Repeated sequences in DNA, Science, 161, 529-540.

Chang S., Cohen S.N. (1977). In vivo site-specific genetic recombination promoted by the Eco RI restriction endonuclease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4811-4815.

Gilbert W. (1981). DNA sequencing and gene structure, Science, 214, 1305-1312.

Greever R.F. et al. (1981). Direct identification of sickle cell anemia by blot hybridization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5081-5085.

Itakura K. et al. (1977). Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin, Science, 198, 1056-1063.

Laird CD., McCarthy B.J. (1969). Molecular characterization of the Drosophila genome, Genetics, 63, 865-882.

Maniatis Т. et al. (1978). The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA, Cell, 15, 687-701.

Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J., 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. [Имеется перевод: Маниа-muc Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Молекулярное клонирование, М., Мир.]

Nathans D. (1979). Restriction endonucleases, simian virus 40, and the new genetics, Science, 206, 903-909.

Roberts R.J. (1976).Restriction endonucleases, CRC Crit. Rev. Biochem., 4, 123-164.

Rodriguez R.L., Tait R.C., 1983. Recombinant

DNA Techniques: An Introduction,

Addison-Wesley, Reading, Mass. Sanger F. (1981). Determination of nucleotide

sequences in DNA, Science, 214, 1205-1210. Smith H. 0. (1979). Nucleotide sequence specificity

of restriction endonucleases, Science, 205,

455-462.

Valenzuela P. et al. (1982). Synthesis and assembly of hepatitis В virus surface antigen particles in yeast, Nature, 298, 347-350.

Wetmur J., Davidson N. (1968). Kinetics of renaturation of DNA, J. Mol. Biol., 31, 349-370.

Ключевые слова и понятия

Библиотека генома

Вектор для клонирования ДНК

Зонд

Карта сайтов рестрикции Кинетика ренатурации ДНК Линкер

Метод Саузерна

Определение нуклеотидной последовательности

Палиндромная нуклеотидная последовательность

Прогулка по хромосоме Рекомбинантная ДНК Уравнение C0t Фермент модификации ДНК Фермент рестрикции ДНК Электрофорез в геле

Задачи

( 9.1./Препарат линейной вирусной ДНК обрабатывают указанными ниже ферментами и их комбинацией. Получившийся набор рестриктов подвергают электрофорезу. На основе представленных в таблице результатов постройте карту рестрикции вирусной ДНК.

.Г9.2ЛПрепарат кольцевой плазмидной ДКК^подвергают действию указанных ферментов, а затем анализируют фрагменты при электрофорезе в геле. Используя представленную информацию, постройте карту рестрикции этой плазмидной ДНК.

Фермент Размеры фрагмента (в т.п.н.) (1 т.п.н. = = 1000 п.н.)

Bgl II 5 и 10

Hga I 5 и 10

Sma I 2 и 13

Bgl II и Hga I 5

Bgl II и Sma I 2, 5 и 8

Hga I и Sma I 2, 3 и 10

Фермент Размеры фрагментов (т. п. н.)

Хта I 20

МЬо I 10

Хта I и Mbo I 3, 7 и 10

> 9.3.УТрепарат линейной вирусной ДНК обрабатывают рестриктазой Sma I до полного расщепления. Электрофорез в геле выявляет присутствие фрагментов еледующих размеров (т.п.н.): 10, 7, 6, 3 и 2. Параллельно интактную вирусную ДНК расщепляют той же эндонуклеазой неполностью. Полученные при неполном расщеплении пять фрагментов обозначены в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Затем каждый из этих фрагментов обработан рестриктазой Sma I до полного расщепления и подвергнут электрофорезу. Полученные результаты представлены в таблице. Постройте карту рестрикции Sma I вирусной ДНК.

Фрагменты, полученные Размер фрагментов

при неполной рестрик- после полной рестрикции ции (в т, п. н.)

А 10; 6; 2

В 7; 6; 2

С 10; 3

D 7; 2

Е 6; 2

9.5. Фрагмент, полученный при расщеплении рестриктазой Bgl II ДНК Cannabis sativa клонируется в сайте Bam HI плазмиды pBR322. При попытке выделить этот важный участок из плазмидной ДНК оказывается, что ни Ват HI, ни Bglll не вырезают ДНК С. sativa из плазмидной. Почему? Какой фермент рестрикции следует использовать, чтобы выделить растительную ДНК из рекомбинантной плазмиды?

9.6. При конструировании векторов серии харон оказывается, что все фаговые частицы несут встроенные участки ДНК. Почему не обнаруживаются фаговые частицы, которые несут лишь левое и правое плечо молекулы ДНК вектора.

Г^Л\Линейный фрагмент ДНК Eco RI длНнотд 2,5 т. п. н. с единственным сайтом рестрикции Hhal клонируется в сайте EcoRI плазмиды длиной 5 т.п.н. Карты рестрикции этих двух молекул ДНК изображены на рис. 9.20. Участки линейной ДНК могут быть клонированы в двух ориентациях.

9.4. Препарат кольцевой плазмидной ДНК длиной 18 т. п. и подвергают полной рестрикции эндонуклеазой Kut I. Электрофорез в геле выявляет наличие фрагментов следующих размеров: 5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 1,5 и 1,0. Неполная рестрикция интактной плазмидной ДНК той же эндонуклеазой с последующим разделением фрагментов посредством электрофореза в геле показывает существование пяти фрагментов, обозначенных в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Результаты последующей полной рестрикции этих фрагментов представлены в таблице. Постройте рестрикционную карту кольцевой плазмидной ДНК.

1) Каковы два способа ориентации?

2) Совместная обработка рестриктаза-ми Hin dill и Hhal дает фрагменты длиной 1 и 6,5 т. п. н. Какова ориентация клонируемого фрагмента?

f 9.8.1 Фрагмент ДНК длиной в 10 пар нуклеотидов был помечен с З'-конца и последовательность нуклеотидов определялась способом, схематически изображенным на рис. 9.8. Результаты представлены в таблице. Какова нуклеотидная последовательность фрагмента?

С Т A G

9.9. Расщепление ДНК фага X рестриктазой Hin dill дает семь фрагментов

(рис. 9.7). Продумайте постановку простого эксперимента с использованием полинуклеотидкиназы, позволяющего определить, какие из двух фрагментов содержат

концевые точки ДНКХ.

9.10. Дано два препарата интактной

ДНК фага X: один дикого типа и второй

X dgal. Фаг X dgal комплементирует мутанты по гену К, но не комплементирует

мутанты по гену J (см. рис. 7.7). Сравните

картину распределения Hin dill - рестриктов, которую вы ожидаете получить пр