ри этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5'-конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду.

Расщепление, по Т

Расщепление — по С? ~~51/Расщепление—, по А

Расщепление-по G

Т

С

А

С

С

С

С

А

Т

Т

Т

А

А

А

1 I

* * * * * # * * * ***** ####

\ I

с I с

т

г

I I А \

Получение исходных наборов радиоактивно меченных фрагментов

Радиоав-тография электрофоретического геля выявляет различия в длине фрагмен -тов

чайной длины оканчиваются определенным нуклеотидом. Все четыре набора фракционируют затем по размерам посредством электрофореза. Нуклеотидная последовательность при этом может считываться непосредственно с радиоавтографа электрофоретического геля (последовательность стрелок от полосы к полосе на диаграмме).

Рис. 9.9. Радиоавтограф электрофоретиче-ского геля, по которому считывают нуклео-тидную последовательность методом Максама - Гилберта. Изображена последовательность нуклеотидов, заключенная между двумя генами а-гло-бина ДНК человека. Фрагмент ДНК был помечен на З'-конце и обработан рестрикта-зами, расщепляющими по G, С, G и А и С и Т (для определения нуклеотидной последовательности нет необходимости в том, чтобы расщепление цепи происходило по единственному основанию). Слева представлена последовательность, которую можно считать с геля.

3'

Метод рекомбинантных ДНК

Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фрагменты ДНК и комбинировать из них in vitro рекомбинантные (или химерные) молекулы. Это оказывается возможно, поскольку многие рестриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй, в результате чего образовавшиеся фрагменты обладают комплементарными одноцепочечными концами (см. табл. 9.1). Эти концы могут соединяться посредством образования водородных связей между комплементарными основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты ДНК, как это показано на

Рис. 9.10. Образование рекомбинантных молекул ДНК. При действии одной рестриктазы на различные молекулы ДНК образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Соединение таких фрагментов в разных сочетаниях может приводить к образованию рекомбинантных молекул ДНК. Под действием ДНК-лигазы формирование рекомбинантных молекул завершается установлением ковалентных связей.

AGAGAATTCCCT TCTCTTAAGGGA

AGAGAATTCCCT TCTCTTAAGGGA

AGAG ААТТСССТ

ТСТСТТАА GGGA

AGAG ААТТСССТ

ТСТСТТАА GGGA

AGAGAATTCCCT TCTCTTAAGGGA

AGAGAATTCCCT TCTCTTAAGGGA

рис. 9.10. После образования водородных связей между комплементарными основаниями концы фрагментов соединяются ковалентными связями под действием лигазы.

Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструировании химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например, плазмиду или эписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации. Репликация такого репликона будет приводить к размножению также второго фрагмента, составляющего рекомбинантную молекулу. Исходный репликон становится при этом вектором для другого фрагмента ДНК.

В качестве таких векторов для клонирования (или клонирующих векторов) любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг % и множество различных плазмид. Вектор с клонируемым фрагментом ДНК может проникнуть в клетку Е. coli после того, как клетка обработана ионами Са+ + . Такая процедура позволяет конструировать штаммы бактерий, несущих определенные фрагменты чужеродной ДНК (клоны), и размно

жать ДНК этих клонов в больших количествах. Совокупность методов, объединяемых названиями «клонирование», или «генная инженерия», произвели революцию в генетике, биохимии и биотехнологии. В настоящее время ДНК эукариотических организмов может изучаться на уровне последовательности нуклеотидов с той же детальностью, которая еще недавно была возможна лишь в отношении ДНК вирусов. Методы генной инженерии позволяют использовать Е. coli в качестве фабрик для производства продуктов функционирования генов человека, например, для производства инсулина и гормона роста. Вероятно, в недалеком будущем это даст возможность успешно и недорого лечить диабет, возникающий при недостатке инсулина в организме, и карликовость, являющуюся следствием недостатка гормона роста. Методы рекомбинантных ДНК открывают широкие перспективы в решении проблем медицины, сельского хозяйства и химической технологии. Эти методы обещают возникновение новой индустрии, называемой биотехнологией, привлекающей в настоящее время внимание средств массовой информации и финансирующих организаций.

Векторы для клонирования ДНК

Методы клонирования чужеродной ДНК в клетках Е, coli удобно проиллюстрировать на примере плазмиды pBR322, специально сконструированной Франциско Болваром и Раймондом Родригесом для клонирования маленьких фрагментов ДНК, состоящих всего из нескольких тысяч пар оснований или еще меньше. Эта плазмида невелика (4362 ну-клеотидные пары), несет гены антибиотикоустойчивости amp и tet и в каждой бактериальной клетке может присутствовать во множестве копий. Последовательность нуклеотидов плазмиды известна. Ее физическая карта представлена на рис. 9.11. Обратите внимание на то, что имеется один сайт для рестриктазы Pst I в гене amp и по одному сайту для рестриктаз Bam HI и Sail в гене tet. Наличие этих сайтов именно

Рис. 9.11. Физическая карта клонирующей

плазмиды pBR322. Эта плазмида сконструирована из трех частей.

Участок начала репликации (ori)- из плазмиды рМВ1; ген tet -из плазмиды

\

pSClOl, а ген amp -из транспозона ТпЗ. Указаны соответствующие уникальные сайты рестрикции.

\

в генах устойчивости к двум антибиотикам дает возможность отбирать плазмиды, несущие чужеродную ДНК (рис. 9.12).

Плазмиду рестрицируют BamHl и образовавшиеся линейные молекулы смешивают с фрагментами чужеродной ДНК, полученными также под действием этой рестриктазы. Одноцепочечные комплементарные концы этих молекул могут соединиться различными способами, прежде чем под действием лигазы возникнут ковалентные связи. Во-первых, концы линейной молекулы ДНК плазмиды могут соединиться друг с другом: при этом восстановится исходная кольцевая плазмида с ин-тактным геном tet. Возможно, однако (именно это и требуется), что перед превращением линейной молекулы ДНК плазмиды в кольцевую, между ее концами встроится фрагмент чужеродной ДНК; при этом целостность гена tet нарушится. Полученной in vitro смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е. coli, предварительно обработанные иоРис. 9.13. Синтетические фрагменты ДНК, содержащие сайты рестрикции, можно использовать в качестве связующих звеньев (линкеров) при создании рекомбинантных молекул. А, Любой фрагмент ДНК без липких концов можно клонировать при использовании двухцепочечных линкеров. Б. Структура трех линкеров.

Линкер

ДНК Лигаза

I1IIIIII1IIIIII1 >

lllllllilllllll

Рестриктаза

EcoRl

с с G\A А Т ТС G G G G CT T A A\G С С

Нра й Bam l НряП

c\c G\G А Т C\C G G

G G C\C T A G\G C\C

С С A\A G G GT T С

С T T G G G A\AC С

нами Са + + с тем, чтобы сделать эти клетки проницаемыми для ДНК. Затем трансформированные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. На таком агаре размножаются лишь те клетки, которые обладают фенотипом AmpR и, следовательно, содержат восстановленную плазмиду или плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК. Колонии, выросшие на среде с ампициллином, перепечатывают на чашки с тетрациклином. Клетки с восстановленной кольцевой плаз-мидой, содержащей неповрежденный ген tet, будут иметь фенотип TetR, тогда как клетки, в плазмиду которых встроен фрагмент чужеродной ДНК, окажутся чувствительными к тетрациклину (Tets). Клоны с фенотипом TetsAmpR можно отобрать для дальнейшего исследования встроенных фрагментов ДНК.

Процедуру клонирования можно вести с помощью рестриктазы Sail, а не ВатШ, и точно так же отбирать колонии трансформантов с фенотипом TetsAmpR; при этом будут клонироваться фрагменты чужеродной ДНК, специфичные именно для Sail и отличные от фрагментов, клонируемых Bam HI. Можно также в качестве рестрицирующего фермента при клонировании с помощью вектора pBR322 использовать Pstl; при этом для дальнейших исследований природы встроенных фрагментов следует отбирать колонии с фенотипом TetRAmps.

Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеоти-дов, получивших наименование «линкеры» (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие «тупоконечные» (т.е. не обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9.13). Эти фрагменты могут «выстригатьт

Eco RI -сайты L I I i R

т'

ДНК харон-фага Д

Геном мыши

Левое плечо

т

Правое плечо Обработка Eco RI

R т'

~-;Л

Внутренние фрагменты

Удаление с помощью электрофореза внутренних фрагментов, несущественных для репликации ДНК фага

Частичное расщепление рестриктазой Eco RI в результате которого образуются фрагменты длиной около 20 ООО Н. п.

т

R т'

Слипание концов и сшивка

т

R т'т L

R т'т L

R т'т L

Упаковка в головки фагов X in vitro

t t ? f t

Заражение E.coli рекомбинантными фаговыми частицами

Популяция харои-фагов X, содержащих в совокупности весь геном мыши

\

Рис. 9.14. Использование харон-фага X для клонирования крупных фрагментов ДНК шлши. Эффективное клонирование оказывается во