роматине. Подавляющее большинство этих последовательностей, по-видимому, играют какую-то роль в структурной организации хромосом, поскольку они не транскрибируются в последовательности РНК. С другой стороны, большинство последовательностей с не столь высокой повторностью распределены по всему геному и транскрибируются в РНК. Природа этих последовательностей активно изучается методами рекомбинантных ДНК, о которых мы расскажем в этой главе.

Дополнение 9.1 Кинетика ренатурадии ДНК

Этапы последовательной денатурации и ренатурации ДНК схематически изображены на рис. 9.1. Ренатурация комплементарных одноцепочечных молекул в двух-цепочечную происходит в два этапа: 1) нуклеация (зацепление), 2) застегивание (наподобие застежки-молнии). Поскольку зацепление включает две одноцепочечные молекулы ДНК, скорость реакции пропорциональна квадрату концентрации ДНК (измеряемому по молярности нуклеотидов) и, следовательно, представляет собой реакцию второго порядка. Напротив, в застегивании принимает участие уже единая двухцепочечная молекула, и потому это реакция первого порядка, а с точки зрения механизма-мономолекулярная. Экспериментально ренатурация ДНК идет в соответствии с кинетикой реакции второго порядка. Следовательно, лимитирующей стадией является установление первых связей между одноцепо-чечными молекулами (зацепление).

Пусть с - концентрация одноцепочечных молекул ДНК в момент времени t, а с0-концентрация в начальный момент t = 0. Тогда уравнение реакции второго порядка, описывающее убывание концентрации одноцепочечной ДНК, имеет вид

dc , . — = к2с2, (1)

dt

где к2 - постоянная скорости реакции второго порядка, или

dc _

' 2 ~~ ^2<*t. С

Интегрирование этого уравнения дает — = knt + const.

или

(2)

Cq 1 -t- к2С(у t

Время, за которое концентрация убывает вдвое (время полуренатурации), обозначается t1/z. Из предыдущего уравнения

0,5 =

1 + /с2с0г1/2

откуда

к->

(3)

На рис. 9.2 представлен график зависимости с/с0 от c0t, он называется с0?-графиком.

офзи

Ветмур и Дэвидсон показали, что константа скорости реакции второго порядка ренатурации ДНК к2 обратно пропорциональна N- числу нуклеотидов в неповторяющихся участках нуклеотидной последовательности гаплоидного генома прокариот. Это соотношение задается формулой

(4)

Зг0,5

fe,=

(5)

где L-среднее число нуклеотидов в одно-цепочечном фрагменте, {3- средняя плотность точек, в которых устанавливается связь между двумя цепями, а-коэффициент. Комбинируя уравнения (3) и (4), мы видим, что величина с0?1/2 прямо пропорциональна JV. (а-коэффициент пропорциональности):

c0t1/2 = aN.

При t = 0 с-с0, следовательно, const — 1

= —. Подставляя, получаем

— =k2t + ?

с

Важность уравнения (5) демонстрируется рисунком 9.3, на котором представлены кривые ренатурации фрагментов ДНК, полученных из молекул ДНК различной сложности.

Для молекул ДНК, для которых известны значения L и N, коэффициент пропорциональности а можно определить по набору значений c0t1/2, получаемых при различных условиях эксперимента (при разных температурах и ионных силах раствора). В этом состоит один из наиболее важных результатов исследования кинетики, а именно: используя один и тот же набор условий эксперимента, можно по значению а рассчитать N для ДНК неизвестной природы.

На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости реакции второго порядка, т.е. в соответствии с уравнением (2). Напротив, кривая ренатурации ДНК эукариотического организма свидетельствует о том, что в процессе ренатурации величина к2 должна изменяться. Для того, чтобы интерпретировать кривые ренатурации ДНК типа изображенной на рис. 9.4, следует предположить, что в ДНК эукариотических клеток присутствуют различные типы нуклеотидных последовательностей, различающихся сложностью и частотой повторов. Часть ДНК, ренатурирующая медленнее всего (т.е. характеризующаяся наиболее высокими значениями c0tli2), отвечает уникальным последовательностям, представленным в геноме однократно. Фракции, ренатурирующие более быстро, соответствуют семействам идентичных или очень близких последовательностей, каждая из которых характеризуется определенным значением константы скорости, отражающим сложность (N) семейства. Долю генома, занятую последовательностями того или иного типа, можно оценить по ординате графика, представленного на рис. 9.4.

Рестрикция ДНК

и ферменты модификации

Практически все виды бактерий синтезируют по одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндо-нуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестрштаза-ми), поскольку их основная функция состоит, по-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментирует-ся, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов.

Таблица 9.1. Последовательности, узнаваемые некоторыми рестрикционными эндонукле-азами

Число сайтов узнавания в вирусном геноме

Микроорганизм

Фермент

Сайт узнавания

SV40

Аденовирус 2

Escherichia coli KY13 Eco RI

5' G A A С T T

T T С 3' A A G

* т

Hemophilus influenzae R. Hin dll d

\

5' G T Py С A Pu

Pu А С 3' Py Т G \

34

>20

Hin dill

Hemophilus parainfluenzac Hpa I

Нра II

Hemophilus aegyptius Нее UI

5' A A G

т т С

\

5' G T T С A A

Г

5' С С G G

\

5' G G С С

С Т Т 3' G А А

т •

А А С 3' Т Т G

3'

G G С С

*т

с с

G G \

18

11

>50

>50

11

>50

>50

is*

1 Звездочками помечены основания, которые могут быть метилированы ферментами модификации. Малыми стрелками указаны разрезы, производимые рестриктазами типа II. Длинная вертикальная линия-ось симметрии. Pu-пурин, Ру- пиримидин.

Размеры геномов: SV40-5224 н.п.; ^.-48 502 н.п.; аденовирус 2-38 200 н.п.

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндону-клеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов.

Рестриктазы второго типа узнают палиндромные последовательности-последовательности, обладающие центральной симметрией и считы-вающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего типа, напротив, узнают асимметричные сайты. В табл. 9.1 представлены сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Как указано стрелОрганизация и передача генетического материала Таблица 9.2. Характеристика сайтов, узнаваемых рестриктазами

Фермент Сайт узнавания

Тип П (N = 7)

Ek I

Симметричный (N = 6)

Bal I TCJG | CCA

Ват HI G | GATCC

Bell TIGATCA

Bgl II AIGATCT

Eco RI GjAATTC

Hin dill A j AGCTT

Hpal GTT| AAC

Kpn I GGTACIС

Pst I CTGCAIG

Pvu II CAGICTG

Sma I CCC | GGG

Sac I GAGCT | С

Sac II CCGC|GG

Sail GITCGAC

Xbal T|CTAGA

Xho I CTCI GAG

Вырожденный симметричный (N = 6)

Асе I GTI (A/C)(G/T)AC

Aval C|PyCGPuG

Hue I (A/T)GG|CC(T/A)

Haell PuGCGC|Py

Hgi Al G(T/A)GC(T/A)|C

HmdII GTPy|PuAC

Симметричный (N = 5)

Asul G|GNCC

Avail G\G(ArT)CC

Eco Rll I CC(A/T)GG

Hmfl G j ANTC

Продолжение табл. 9.2.

Фермент

Сайт узнавания

Симметричный (N = 4) Alu I Fnu DII Нае III Hha I-Нра II МЬо I

Taq I Симметричный метилированный

Ори I

Msp I

AG|CT

CG|CG

GG|CC

GCG|C

C|CGG

|GATC

T|CGA

GmATC C(mC/C)GG

Type III Ассиметричный (N = 5)

Hgal Hphl Mbo II

GACGCNNNNN|(3') CTGCGNNNNNNNNNN| (5') GGTGANNNNNNNN| (3') CCACTNNNNNNN|(5') GAAGANNNNNNNN|{3') CT T CT NNNNNNN|(5')

1 Для ферментов типа II последовательность представлена лишь в одной цепи; комплементарную последовательность можно достроить. Вертикальная линия обозначает положение, в котором разрываются фосфодиэфирные связи. Звездочки указывают основания, которые могут быть метилированы соответствующими ферментами модификации.

2 Специфический сайт узнавания Dpn I содержит метилированный аденин (тА), тогда как сайт Mbo I содержит неметилированное основание. Msp I узнает указанную последовательность независимо от метилированное™ внутреннего С; Нра II