е подвижные генетические элементы были описаны Барбарой Мак-Клинток еще в 1951 году на кукурузе. Она назвала их контролирующими элементами, поскольку они встраивались по соседству с некоторыми генами, в частности, генами, определяющими пигментацию зерен, и оказывали влияние на этот признак растения. Мак-Клинток описала также способность контролирующих элементов

перемещаться по геному. В настоящее время стало ясно, что подвижные генетические элементы составляют неотъемлемую часть генома как прокариотических, так и эукариотических организмов. Описание структуры этих элементов на молекулярном уровне началось с прокариот, поскольку соответствующие методы исследования ДНК прокариотических организмов были разработаны в 70-х годах, тогда как метод рекомбинантных ДНК, позволяющих на том же уровне исследовать ДНК эукариотических организмов, стал доступен лишь в 80-х годах. Вспомним о подвижных элементах в гене white дрозофилы (рис. 6.17).

Генетическое картирование Е. coli

Метод прерванной конъюгации удобен при физическом картировании генов, довольно удаленных друг от друга, но не может использоваться при картировании маркеров, находящихся на близком расстоянии. Такие локусы картируют посредством рекомбинационного анализа, основанного на тех же принципах, которые были использованы при постановке трехфакторных скрещиваний (гл. 5 и 7).

Для рекомбинационного картирования требуется клетка реципиента с кольцевой ДНК хромосомы и ДНК донорной клетки. ДНК клетки-донора может вводиться в клетку реципиента различными способами: с помощью Hfr-хромосомы (при конъюгации), вместе с фагом-вектором (трансдукция), или путем прямой передачи ДНК из клетки донора в клетку-реципиент, как это описано в гл. 4 в отношении пневмококков (трансформация). Образующаяся при этом частично диплоидная клетка называется мерозиготой. Мерозиготы нестабильны, поскольку донорная ДНК представляет собой фрагмент целого репликона. Генетические

Сайт селектируемого обмена

Частота рекомбинации между В и С =

Вероятные сайты > неселектируемых обменов

число рекомбинантов ЬС число рекомбинантов С

в отличие от скрещивания между мейотическими организмами, реци-прокные рекомбинанты в таком скрещивании не образуются, расстояния на генетической карте, определяемые таким образом, не аналогичны расстояниям, определяемым при скрещивании мейотических организмов.

маркеры, содержащиеся в донорной ДНК, могут реплицироваться и сохраниться в потомстве, только если они попадают в репликон клетки-реципиента в результате рекомбинации. Как показано на рис. 8.14, для того, чтобы часть донорной ДНК встроилась в хромосому реципиента и при этом сохранилась кольцевая структура хромосомы, требуется два (или даже несколько) кроссинговеров.

Конъюгационное картирование

Когда производится картирование мерозигот типа F ~, образовавшихся при конъюгации с клетками Hfr, полезно знать порядок попадания фланкирующих маркеров в клетку F ~. Картирование выполняется посредством отбора по дистальному маркеру С (рис. 8.14). Эта процедура гарантирует участие в конъюгации всех интересующих нас маркеров. Частота появления неселективных маркеров у отобранных рекомбинантов используется для определения расстояния на карте от неселективного маркера до С, как это изображено на рис. 8.14. Например, тесно сцепленные мутации, влияющие на способность утилизировать лактозу в качестве источника углерода (lac У, lacZ и lac I) в реципрокных скрещиваниях 6 и 7 передаются определенным штаммом Hfr после маркера pro +, но до маркера ade + .

Скрещивание 6: Hfr, Уд Z% It ade + sti^ х

F ", YЈ Zl II ade ~ str*

Скрещивание 7: Hfr, YЈ Z4 / J ade + sti^ x

F -, Y^Ztlt ade ~ str*.

Рекомбинанты ade+ str* отбираются при посеве на агар с глюкозой и стрептомицином. Представленные в табл. 8.3 данные основаны на анализе генотипа более чем 10000 таких рекомбинантных колоний, отТаблица 8.3. Частоты неселективных маркеров среди рекомбинантов ade+str , образуемых мерозиготами

Скрещивание 6

Скрещивание 7

у + 1 R

ade+ ade~ 3

Среди рекомбинантов ade + strR (кроссинговер в 4):

A. 22% -Y\Zl (кроссинговер в 2 или 3)

Б. 2,3%-7^4/3 (кроссинговер в 1)

B. 0,20%- YKZX 1ъ (кроссинговер в 2 или 3 и

слева от У)

Г. 0,048%- YRZ^IJ (кроссинговер в 1,2 и 3) str

Z4

П

Hfr Y+R

F~ У^ Z4 Ц ade~ str

Участок 12 3 4

Среди рекомбинантов ade+strR (кроссинговер в 4):

A. 26%-Y^Z^ (кроссинговер в 2 или 3)

Б. 1,9%-YjjZj (кроссинговер в 2 или 3 и 1 и слева от У)

B. 1,4%-7^4/3" (кроссинговер в 2)

Г. 0,22%- Y\Z% /J (кроссинговер в 1 и 2 и слева от У)

По Jacob F., Wollman E.L. 1961. Sexuality and the Genetics of Bacteria, Academic Press, New York, p. 229.

Скрещивание 6

Hfr Y- Z+ /+ ade+ sfrs'

Ж Ж

I I

I I

V V

Y+ Z~ /- ade- slrR

Y+ Z~ 1 ade+ strR

Hfr Y- Z+ 1+ a

Y+ Z~ I~ ade- strR

F~ Y+ Z+ 1+ ade+ sir"

Hfr Y" Z+ J+ яй"е+ s/rs

ж

Y+ Z- /- ade- s/r*

Hfr Y~ Z+ 7+ sfr"s

F~ Y- Z+ /- ade+ sir*

Ж ж ж

ж к к

Y+ 1- \~ ade~ strR

F" Y+ Z+ I" ade+ sir

Скрещивание 7

Hfr Y+ Z- Г sfrs

Ж—Ж

t 1

к к -

Y~ Z+ 1+ й^" sir*

F Y- Z+ I ude+ strR

Y- Z+ /+ ade- strH

F~ y- Z+ J- ade+ str*

Y+ Z~ I' ade+ strs

—Ж—

V V V

Y- Z+ /+ ade- sir*

Y+ Z+ J- яЛ>+ sfr*

Рис. 8.15. Образование селективных и неселективных рекомбинантных генотипов в скрещиваниях 6 и 7 из таблицы 8.3. Все рекомбинанты содержат ген ade+ (кроссинговер обозначен цветной стрелкой). Другие

возможные обмены обозначены черными стрелками. Пунктирными стрелками обозначены кроссинговеры, положение которых по отношению к гену lad не определено.

pro4

ade

20

\

22

\

Рис. 8.16. Генетическая карта /ас-области Е. coli.

печатанных на чашки с питательной средой, позволяющей идентифицировать различные фенотипы Lac. Самый многочисленный класс рекомбинантов, полученных в этих скрещиваниях, позволяет определить расстояние на карте между ade и lacZ. В шестом скрещивании это расстояние оценивается в 22 единицы, в реципрокном седьмом скрещивании-в 26 единиц; такое соответствие можно считать удовлетворительным. На рис. 8.15 схематически изображены кроссинговеры, необходимые для возникновения рекомбинантов этого и других типов, представленных в табл. 8.3. Рекомбинанты классов В, С и D, полученные в скрещивании 6 (рис. 8.15), позволяют сделать вывод, что lacl лежит между lac Z и ade, поскольку четырехкратный кроссинговер, в результате которого образуются классы С и D, должен происходить много реже двойного. Сравнение классов С и D с классом В показывает, что по аналогичной причине lac Z должен лежать между lac I и lac Y. Реципрокное скрещивание 7 подтверждает установленную в скрещивании 6 последовательность расположения генов. Полученные в этих скрещиваниях частоты четырехкратного кроссинговера свидетельствуют о существовании высокой отрицательной интерференции (см. гл. 14). На рис. 8.16 изображена рекомбинационная карта, построенная по данным, приведенным в табл. 8.3, и другим данным, полученным при использовании в качестве маркера аллелей локуса pro.

Сопоставление физической карты, полученной методом прерванной конъюгации, и генетической карты, построенной на основании данных о частоте рекомбинаций, показывает, что 1 минута продолжительности конъюгации соответствует 20 единицам генетической карты. Полная длина хромосомы Е. coli составляет 100 минут или 2000 единиц генетической карты. Одна единица карты соответствует примерно 1600 н. п. Очевидно, что рекомбинационное картирование удобно лишь при малых расстояниях между исследуемыми локусами, поскольку маркеры, удаленные друг от друга более, чем на 3 минуты, расщепляются практически независимо, т.е. ведут себя как несцепленные гены.

Трансдукционное картирование

Результаты, получаемые при рекомбинационном картировании мерози-гот, желательно подтверждать реципрокными скрещиваниями, как это делалось в случае скрещиваний 6 и 7. Однако создание штаммов Hfr и F ~, необходимых для проведения реципрокных скрещиваний, часто дело непростое, и в большинстве случаев рекомбинационное картирование у Е. coli производится другим методом, а именно, с использованием ме-розигот, возникающих при трансдукции умеренным бактериофагом Р1.

После того, как Р1 инфицирует чувствительную клетку Е. coli, развитие может пойти либо по литическому пути, что приводит к появлению потомства фага, либо по пути лизогенизации. При образовании фагового потомства в головки зрелых частиц с помощью механизма, обеспечивающего заполнение головки Т4 максимальным количеством ДНК, упаковываются молекулы ДНК Р1 протяженностью примерно 105 н.п. В отдельных фагах последовательности нуклеотидов представляют собой циклические перестановки друг относительно друга. Иногда, однако, в головку фага вместо его собственной ДНК упаковывается фрагмент хромосомы клетки-хозяина, разрушенной в процессе лизиса. Частота образования таких дефектных фаговых частиц составляет около 2 :1000 потомков фага. Дефектные частицы фага, содержащие ДНК Е. coli могут быть выявлены посредством генетического анализа при наличии в ДНК Е. coli генетических маркеров. Например, если клетка thr ~ «инфицирована» фагом, содержащим фрагмент ДНК Е. coli с геном thr+, то ген thr+ может включаться путем рекомбинации в хромосому бактерии. В результате образуется прототрофный реком-бинант, способный к росту в отсутствие треонина (рис. 8.17). Фаг Р1 осуществляет общую (неспецифическую) трансдукцию; это значит, что он способен переносить любые гены бактерий. Такие фаги следует отличать от специфически трансдуцирующих фагов (к ним относится фаг X), которые переносят лишь те бактериальные гены, которые локализованы неподалеку от сайта интеграции профага.

Когда фаг Р1 размножают на клетках thr + leu + aziR, и затем полученным препаратом фага инфицируют реципиента th