приводить, как это указано на рисунке, к возникновению либо F'-штамма с интактным (неповрежденным) F-фактором, либо F'-штамма, содержащего F-фактор с делецией.

h^KUkh U k к к к КК-хК-г&пь

1 1

J

(рис. 8.10). Кольцевой F-фактор, включающий в себя бактериальные гены, представляет собой самостоятельный репликон, получивший наименование F'-элемента. F'-элементы обычно, так же как и сам F-фактор, инфекционны, и их копии переносятся в F " -клетки. F'-штаммы отличаются от штаммов Hfr поведением при скрещивании с клетками F ~. Сравните результаты скрещиваний 4 и 5, в которых использовались штаммы Hfr и F', полученный из него. Смешанные культуры высевали на минимальную среду, содержащую стрептомицин.

Скрещивание 4: Hfr, Thr+ Leu+ Str* x F", Thr" Leu" StrR Результат: отбираются рекомбинанты F~,Thr+ Leu+ StrR Скрещивание 5: F', Thr + Leu + Str8 x F "~, Thr ~ Leu "* StrR Результат: отбираются рекомбинанты F', Thr+ Leu+ StrR. Колонии, отобранные в четвертом скрещивании, принадлежат F" типу и не способны передавать гены thr + и 1еи+ клеткам F ~ типа. Напротив, клетки колоний, полученных в пятом скрещивании, содержат активный F-фактор, обеспечивающий им способность скрещиваться с клетками типа F ~ и передавать им Thr + и Leu +. Потомство от таких скрещиваний фенотипически будет принадлежать F + -типу; клетки при этом содержат F'-элемент.

При передаче F'-элемента F " -клеткам возникает так называемая частичная диплоидность. Такая частичная диплоидность позволяет осуществлять комплементационный анализ различных мутантов и выявлять доминантность или рецессивность различных аллелей определенных генов. Примеры использования результатов таких исследований приводятся в гл. 15.

В частично диплоидной клетке рекомбинация может происходить между генами бактерии, входящими в состав F'-элемента, и генами гомологичного участка бактериальной хромосомы. Единичный кроссинговер приводит к включению F'-элемента в бактериальную хромосому и образованию клетки типа Hfr с дупликацией генов, содержащихся в F'-элементе. Двойной кроссинговер приводит к образованию клетки F'-типа, в которой произошел обмен маркерами между бактериальной хромосомой и F'-элементом.

Подвижные генетические элементы (транспозоны)

Привычные представления о стабильности генетической организации были сильно поколеблены в 70-х годах исследованиями подвижных генетических элементов у бактерий. Первые такие элементы у бактерий получили название инсерционных последовательностей (IS) или вставок. У Е. coli они были выявлены как причина возникновения определенного типа мутаций. Эти мутации полностью подавляют экспрессию гена, в котором они происходят.

Рис. 8.11. Электронная микрофотография гете-родуплексной молекулы ДНК Xgal + /ХдаВ. Одноцепочечная петля (указана стрелкой)- это вставка IS2 в гене gal+ [Ahmed А,, Scraba D. (1975). Mol. Gen. Genet, 136, 233.]

Исследование гетеродуплексных молекул, образованных ДНК мутанта и ДНК дикого типа, показало, что инсерционные мутанты содержат участки ДНК, встроенные в молекулу ДНК дикого типа (рис. 8.11). Было обнаружено, что несколько различных встраивающихся последовательностей могут вызывать мутации многих генов. Некоторые свойства наиболее известных из этих последовательностей представлены в табл. 8.1. Они различаются размером, но имеют некоторые общие черты строения. На концах содержатся одинаковые или почти одинаковые нуклеотидные последовательности, расположенные, однако, в обратном порядке. В случае IS1, например, концевые последовательности содержат по 23 нуклеотида, 18 из которых одинаковы для обоих

концов. Кроме того, когда инсерция встраивается в ДНК-мишень, небольшой участок последовательности ДНК-мишени повторяется около каждого конца инсерции. Эта повторяющаяся последовательность ДНК, окаймляющая инсерцию, содержит обычно от 5 до 9 нуклеотидов.

Инсерционные последовательности обладают следующими генетическими свойствами:

1. Наиболее характерная особенность-это способность перемещаться по геному. При этом происходит репликация инсерционной последовательности: исходный экземпляр остается в прежнем сайте, а копия встраивается в мишень. Сайты-мишени, куда встраиваются инсерционные последовательности, вообще говоря, почти не обладают специфичностью. Функции, обеспечивающие способность к перемещению (транспозиции), закодированы в самой инсерционной последовательности и жестко регулируются, поскольку транспозиция представляет собой редкое событие, происходящее на порядок реже, чем сами спонтанные мутации.

2. Инсерционные последовательности могут точно вырезаться; при этом происходит реверсия IS-индуцированной мутации к дикому типу.

3. В сайтах, смежных по отношению к инсерции, возникают делеции бактериальных генов (рис. 8.12).

4. В смежных по отношению к инсерции сайтах происходят инверсии бактериальных генов.

5. Инсерционные последовательности обеспечивают взаимодействие между такими генетическими элементами, как F-фактор и бактериальная хромосома.

Возможные механизмы реализации этих свойств мы обсудим в гл. 14, а здесь лишь прокомментируем последнее свойство.

Физическая карта F-фактора Е. coli изображена на рис. 8.13, А. Она содержит 94 500 н. п., в ее состав входят гены, обеспечивающие конъюгаISl

—>

nadA aroG К ТЕ OP chl D pql att\ bio uvr В

Рис. 8.12. Цветными линиями обозначены делеций, индуцируемые элементом IS1 в #а/-опероне Е. coli.

ционный перенос хромосом (гены tra), и гены, обеспечивающие репликацию самого F-фактора. Кроме того, карта включает четыре инсерционных последовательности: две IS3', оДну последовательность IS2 и одну, так называемую у5. Эти последовательности представляют собой сайты, которыми F-фактор встраивается в хромосому бактерии, что и приводит к возникновению клетки Hfr. Свидетельствующие об этом

Рис. 8.13. А. Физическая карта F-фактора Е. coli, на которой изображена локализация генов, необходимых для передачи хромосомы, и IS-эле-менты, ответственные за интеграцию F-фактора в бактериальную хромосому. Б. Физическая карта фактора устойчивости, на которой указаны области гомологии с F-факто-ром и сайты устойчивости к некоторым антибиотикам, окаймленные IS-эле-ментами и образующие транспозоны. Обратите внимание на то, что транспозон ТпЗ, несущий ген amp, представляет собой часть более крупного транспозона Тп4.

х

и

о к . о

5 " о

ь ? о

4z

tet

ХРО.

fl vM

cinl

?О \т\ Я

sir

кап

данные были получены при изучении структуры F'-элементов посредством гетеродуплексного картирования. В ДНК F'-элемента бактериальная ДНК, интегрированная в F-фактор, отделена с обеих сторон от ДНК F-фактора идентичными инсерционными последовательностями. Способность F-фактора встраиваться в различные участки хромосомы Е. coli может быть обусловлена двумя событиями: кроссингове-ром между инсерционными последовательностями, входящими в состав как F-фактора, так и бактериальной хромосомы, либо транспозицией инсерционной последовательности F-фактора в мишень бактериальной хромосомы, приводящей к слиянию двух отдельных кольцевых репли-конов в один (см. гл. 14).

Инсерционные последовательности относительно невелики и кодируют лишь функции, необходимые для их транспозиции. Второй класс подвижных элементов, так называемые транспозоны (Тп), содержат кроме того гены, не имеющие отношения к транспозиции, но сообщающие важные свойства клеткам бактерии-хозяина. Структурные свойства некоторых транспозонов представлены в табл. 8.2. Некоторые транспозоны, например Тп5, содержат на каждом конце известную инсерцион-ную последовательность. Эти последовательности могут быть как одинаково, так и противоположно направленными. Другие транспозоны на концах содержат простые инвертированные повторы, по размерам близкие инсерционным последовательностям. Тот факт, что две одинаковые инсерционные последовательности могут функционировать согласованно, обеспечивая транспозицию инвертированного участка ДНК, как в случае Тп5, свидетельствует о том, что другие транспозоны, в настоящее время устроенные по-другому, могли эволюционно возникнуть из такой структуры в результате утраты большей части внутренних участков исходной предковой инсерционной последовательности. Так же как и в случае инсерционных последовательностей, перемещение транспозонов приводит к образованию повторов в последовательности ДНК-мишени по обоим концам транспозона.

Впервые транспозоны были обнаружены, когда оказалось, что некоторые гены устойчивости к антибиотикам связаны с инфекционными факторами устойчивости. Общая структура факторов устойчивости изображена на рис. 8.13, Б. При исследовании гетеродуплексной ДНК, образованной ДНК F-фактора, и фактора устойчивости обнаружена гомология по всей области Ira-генов, что свидетельствует об эволюционном родстве этих структур. Последовательность ДНК, кодирующая устойчивость к тетрациклину, tet, обрамлена элементами IS 3 и встроена в область гомологии фактора устойчивости и F-фактора. В негомологичной области карты локализованы гены, кодирующие резистентность к ампициллину (amp), сульфонамиду (sul), стрептомицину (str), хлорамфе-николу (стГ) и канамицину (кап). Эти гены устойчивости порознь или группами обрамлены IS элементами или другими инвертированными повторами (указаны стрелками на рис. 8.13, Б). Отдельные гены устойчивости например, tet или amp, могут переноситься в другие эписомы или плазмиды, а также в хромосомы фагов и бактерий, почему и возник термин транспозон.

Наиболее крупный из известных транспозонов-это умеренный бактериофаг Ми. Ми может в форме профага встраиваться в любое место генома Е. coli, инактивируя гены, оказавшиеся на месте мишени. При литическом развитии Ми ДНК для репликации должна быть встроена

в хромосому хозяина. Выделенная из фага Ми ДНК содержит, кроме линейного генома фага, присоединенные к каждому его концу короткие случайные последовательности ДНК бактерии-хозяина. В случае, когда участок бактериальной хромосомы заключен между двумя Ми-геномами, он может транспозироваться целиком.

Интересно, что впервы