Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

инации. Если же мутант ауксотрофен по двум аминокислотам, то частота реверсии к дикому типу должна составлять 106 • 106 = = 1012. Однако, при использовании таких двойных ауксотрофов в эксперименте колонии дикого типа на минимальной среде образовы

вались с частотой примерно 1 - IO5, т.е. много чаще, чем этого можно было бы ожидать, основываясь на предположении об обратных мутациях. Эти эксперименты обнаружили существование у ?. coli двух половых типов, обозначенных символами F + и Затем было установлено, что клетки типа F + содержат F-фактор, или эписому, тогда как в клетках F ~ -типа эта эписома отсутствует.

Дальнейшие исследования бактерий двух типов привели к поразительному и совершенно неожиданному открытию: оказалось, что F-фактор инфекционен. Когда обладавшие F-фактором и чувствительные к стрептомицину клетки (Strs, F +) смешивали со стрептомицинустой-чивыми бактериями (StrR, F "), и эту смесь высевали на агар, содержащий стрептомицин, то колонии образовывали, естественно, лишь 81тк-клетки, т.е. клетки, несущие аллель str*. Большинство из этих колоний оказалось F + -, а не F " -типа. F-фактор содержит множество генов, сообщающих ему инфекционность. Некоторые из этих генов кодируют белки пилей, структур типа трубочек, расположенных на поверхности F + -клеток (рис. 8.3). F-пили соединяются с соответствующими рецепторами на поверхности F ~ -клеток, что приводит к образованию цито-плазматического мостика между двумя клетками. В процессе роста F + -клеток F-фактор реплицируется по тета-типу, так же как и бактериальная хромосома. Однако, когда между F+ - и F" -клетками возникает цитоплазматический мостик, F-фактор переходит к реплика

ции по сигма-типу (см. гл. 4). 5'-Р04 одн оцеп очечный конец реплицирующегося F-фактора проникает в F ~ -клетку, и там синтезируется комплементарная цепь. Репликация ДНК F-фактора приводит к переносу копии F-фактора в F"-клетки, превращая их в F + -клетки (рис. 8.4).

Как уже упоминалось ранее, F-фактор представляет собой эписому, которая может либо существовать самостоятельно, либо встраиваться в репликон бактерии. В встроенном состоянии F-фактор может переносить бактериальную хромосому в F " -клетки. Частота возникновения рекомбинантов дикого типа для генов бактериальной хромосомы при скрещивании F + - и F ~ -штаммов очень низка (порядка одной клетки на 105 родительских клеток), поскольку лишь небольшое число клеток F + -культуры участвует в образовании рекомбинантов, хотя частота инфицирования F-фактором довольно высока. Однако, из F+ -культуры можно выделить штаммы, при скрещивании которых с F" -клетками рекомбинанты образуются гораздо чаще (частота рекомбинации > 10 2). Эти штаммы обозначаются символом Hfr (от англ. high frequency recombination -высокая частота рекомбинации). В них F-фактор в свободном, автономном состоянии отсутствует, он встроен в бактериальную хромосому. Когда клетки Hfr вступают в контакт с клетками F ", между ними образуется цитоплазматический мостик, называемый копьюгационной трубкой, и интегрированный F-фактор инициирует репликацию бактериальной хромосомы по типу катящегося кольца с того сайта, в который он встроен. Эта репликация приводит к переносу бактериальной хромосомы в F ~ -клетку (рис. 8.5).

Когда копия бактериальной хромосомы клетки Hfr попадает в клетку F ", становится возможной рекомбинация между генетическими маркерами, содержащимися в хромосоме клетки Hfr, и генами, содержащимися в хромосоме F " -клетки (рис. 8.5). При конъюгации клеток Hfr и F ~ часто происходит разрушение соединяющей их конъюгационной трубки и, соответственно, обрыв хромосомы Hfr. В результате в F"-клетку целая Hfr-хромосома попадает довольно редко.

После того, как конъюгация инициирована, возникновение рекомбинантов дикого типа определяется исключительно жизнеспособностью F"-родителя. К такому выводу можно прийти при анализе результатов реципрокных скрещиваний, выполняемых на минимальной среде, содержащей стрептомицин.

Рис. 8.5. Мобилизация бактериальной хромосомы при включении F-фактора в клетке Hfr. При конъюгации репликация хромосомы начинается с встроенного F-фактора. Отрезок F-фактора входит 5'-концом в F"-клетку и увлекает за собой ДНК Hfr-клетки, Если конъюгацию прервать до того, как в клетку перейдет вся Hfr-xpo-мосома, то клетка-реципиент сохранит F^ -тип.

Скрещивание 1: Hfr, Thr + Leu + Strs х F ", Thr - Leu " StrR Результат: колонии образуют лишь рекомбинанты Thr+ Leu+ StrR. Скрещивание 2: Hfr, Thr^ Leu" StrRxF", Thr+ Leu+ Sir5. Результат: колоний нет.

Первое скрещивание показывает, что применение стрептомицина устраняет колонии, которые в противном случае образовались бы из клеток родителя Hfr. Формировать колонии могут только рекомбинанты дикого типа, поскольку родители F ~~ -типа не могут расти на минимальной среде в отсутствие треонина и лейцина. Второе скрещивание показывает, что для образования рекомбинантов необходима жиз

неспособность родителя F ~, а не Hfr. Рекомбинантные колонии StrR не образуются, поскольку ген strR локализован слишком далеко от сайта, с которого начинается передача хромосомы и потому почти никогда не попадает в F " -клетку.

То, что поступление бактериальных генов из Hfr в F " -клетку происходит последовательно, всегда начиная с сайта интеграции F-фактора в бактериальную хромосому, дает возможность картировать гены по порядку их попадания в F " -клетку (подробнее мы обсудим это в следующем разделе). Как показано на рис. 8.5, проникновение хромосомы в F " -клетку всегда начинается с нуклеотидной последовательности интегрированного F-фактора. При этом в F _ -клетку поступает не весь F-фактор. Для того чтобы в клетку попала оставшаяся его часть, необходимо, чтобы в F" перешла вся Hfr-хромосома. Это случается очень редко из-за спонтанных разрывов конъюгационной трубки, и поэтому большинство отбираемых рекомбинантов остаются принадлежащими F ~ -типу.

Физическое картирование бактериальных генов методом прерванной конъюгации

Последовательное поступление генов из Hfr в F " -клетки представляет возможность картировать их в бактериальной хромосоме в соответствии с порядком и временем их попадания в клетки. Рассмотрим, например, следующее скрещивание.

страполяция графиков для частоты каждого из неселективных маркеров к оси абсцисс дает время от начала конъюгации, по прошествии которого маркер становится способен к рекомбинации с хромосомой F -клетки.

Скрещивание 3: Hfr, Thr+ Leu+ Azs Tls Lac + Gal + , Strs x F", Thr" Leu~ AzR T1R Lac Gal- StrR

Скрещивание между указанными штаммами начинается со смешивания двух культур в момент времени t = 0. Через последовательные интервалы времени из смеси отбирают пробы и резко взбалтывают их на мешалке с тем, чтобы разрушить конъюгационные трубки, соединяющие скрещивающиеся клетки. Затем образец высевают на агар со стрептомицином, содержащий в качестве источника углерода глюкозу. На этой среде отбираются рекомбинанты Thr+ Leu+ Str1*. Соответствующие три маркера thr+, 1еи+ и strR, называются селективными. Гены, обусловливающие чувствительность к азиду (azi), к фагу Tl (ton), гены утилизации лактозы (lac) и галактозы (gal) являются в данном случае неселективными маркерами, поскольку среда, на которой выращиваются клетки, не позволяет различать аллели этих локусов у участвующих в скрещиваниях бактерий. Затем отобранные рекомбинанты Thr + Leu + StrR пересевают на различные среды, с тем чтобы определить генотипы этих рекомбинантов по неселективным маркерам. Частота соответствующих аллелей откладывается на графике как функция от про

должительности скрещивания (рис. 8.6). Полученные кривые показывают, что различные неселективные маркеры Hfr становятся способны к рекомбинации с хромосомой F ~ -клеток по истечении различного времени от начала скрещивания (рис. 8.7). Экстраполяция частоты каждого маркера к нулю указывает время попадания маркера в F~-клетку (рис. 8.6). Эти данные позволяют упорядочить гены по Hfr хромосоме, начиная от точки интеграции F-фактора, и оценить физические расстояния между ними, измеряя эти расстояния в минутах, прошедших с начала скрещивания.

Кольцевая форма генома Е. coli

Из одного F + штамма может возникнуть множество различных штаммов Hfr, для каждого из которых характерна собственная локализация и ориентация F-фактора в хромосоме бактерии (рис. 8.8). Это проявляется в описанных выше опытах с прерванной конъюгацией: в каждом Hfr-штамме передача бактериальной хромосомы начинается с собственной, иной чем у других штаммов точки; различна также и ориентация хромосомы при этом. Для каждого штамма можно установить характер сцепления между генами, расположенными неподалеку от точки, с которой начинается передача бактериальной хромосомы. Совокупность таких данных по множеству различных штаммов Hfr позволяет установить характер сцепления маркеров в хромосоме в целом и построить физическую карту хромосомы Е. coli. Как показано на рис. 8.9, эта карта имеет форму кольца, что полностью соответствует кольцевой форме бактериальной ДНК.

Рис. 8.8. Сайты интеграции F-фактора в хромосому некоторых Hfr-штаммов Е. coli. Вставки обозначены стрелками, направление которых соответствует направлению передачи хромосомы при конъюгации. Стрелки внутри хромосомы указывают отношения сцепления, установленные для некоторых Hfr-штаммов. Наложение этих стрелок свидетельствует о кольцевой форме генетической карты.

F-штаммы и частичные диплоиды

F-фактор, интегрированный в геном клеток Hfr штамма, иногда может спонтанно «вырезаться» из хромосомы. Клетка при этом из Hfr превращается в F +. Неточное вырезание может привести к тому, что ставший автономным F-фактор захватывает смежный участок бактериальной хромосомы или, наоборот, теряет некоторый участок собственной ДНК

Рис. 8.10. Образование Hfr-штамма в результате интеграции F-фактора в бактериальную хромосому; последующее вырезание приводит к возникновению либо F + -, либо F'-штамма. Символами /' и Ь' обозначены произвольные сайты F-фактора и бактериальной хромосомы, соответственно. Два типа неточного вырезания F-фактора могут

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)