Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

что существуют четыре отдельные последовательности событий, которые все вместе приводят к сборке фага. Во-первых, репликация родительской ДНК инфицировавшего клетку фага приводит к наработке пула ДНК фага Т4. Во-вторых, ДНК управляет синтезом многочисленных белков, необходимых для морфогенеза головки фага (капсида), хвостового отростка и его нитей (фибрилл).

Синтез головки фага завершается упаковкой в нее молекулы ДНК. Затем к головке прикрепляется уже собранный отросток. И наконец, к отростку крепятся нити, и сборка фага завершена. Изображенная на рис. 7.2 детальная последовательность событий на каждом этапе была расшифрована посредством генетического анализа мутаций, влияющих на развитие фага Т4. В этой главе мы расскажем о том, как генетический анализ помогает понять устройство и работу вирусного генома.

Мутантные бактериофаги

Как уже говорилось в предыдущей главе, лишь немногие фаговые гены имеют мутации, изменяющие морфологию негативных колоний. С другой стороны, очевидно, что во всех существенных для размножения генах фага, могут происходить летальные мутации, делающие невозможным появление фагового потомства. Мутанты, не жизнеспособные

Таблица 7.1. Фенотипы sus-мутантов фага в бактериях с различными генотинами

Генотип фага Генотип бактерии-хозяина1

Su" J и amber С..+

"и ochre $и+ора1

Дикий тип + + + +

— + + —

— — + —

susopal — — — +

1 « + » потомство есть, « —» потомства нет.

в одних условиях и развивающиеся нормально в других, называются условно летальными. Они могут быть размножены и исследованы. В генетике фагов важны два основных типа условно летальных мутантов.

Первый тип-это температурочувствителъные мутанты (ts). Большинство фагов способно инфицировать хозяина и размножаться в широком интервале температур. Температурочувствительные мутанты многих фагов Е. coli способны размножаться при 30°С (пермиссивные условия), но теряют эту способность и обнаруживают свой мутантный фенотип при температуре 40-42°С (непермиссивные условия). При такой температуре негативные колонии не образуются. Известны также мутанты, чувствительные к холоду (cs). Появление температурной чувствительности почти всегда свидетельствует о том, что в каком-то участке ДНК, кодирующем некоторый белок, произошла мутация, повлекшая за собой аминокислотную замену. В результате белок становится нестабилен при непермиссивной температуре и утрачивает активность.

Второй тип условно летальных мутантов-супрессорчувствительные мутанты (sus). Фаги с мутацией sus могут размножаться при инфицировании бактериальных клеток с геном супрессора Su+, т. е. в пермиссивных условиях, но не в состоянии размножаться при инфицировании клеток других штаммов, не содержащих гена супрессора (Su ~), т. е. в непермиссивных условиях. Фаг дикого типа размножается в клетках обоих типов (табл. 7.1). Супрессорчувствительные мутации в отличие от мутаций специфичности к хозяину не влияют на способность фага адсорбироваться. Такой фаг нормально прикрепляется к поверхности бактерии, вводит в нее свою ДНК и даже может убить клетку-хозяина, но не способен к размножению. Существуют три класса супрессорчув-ствительных мутаций, amber(am), ochre [осп) и opal(op). Здесь мы лишь упомянем о них как о генетических маркерах. Они могут затрагивать все гены, кодирующие синтез белков. Мутация нарушает синтез белка в клетках хозяина типа Su " , но не препятствует синтезу белка в клетках типа Su +. Биохимическую природу этих мутаций и механизм супрессии мы обсудим в гл. 12.

После этого краткого обзора различных типов мутантных фагов вернемся к генетическому анализу фаговых мутаций. Это позволит нам понять организацию генома вирусов.

Комплементационный анализ условно летальных мутаций фага 0 Х174

Фаг фХ 174-мелкий вирус, содержащий кольцевую одноцепочечную молекулу ДНК (рис. 7.3). После проникновения в клетку-хозяина синтезируется комплементарная цепь ДНК и образуется двухцепочечная молекула, которая затем в начале скрытого периода реплицируется по полуконсервативному механизму. После того как нарабатывается достаточное количество белков головки и начинается сборка фагов, ДНК начинает реплицироваться посредством видоизмененного сиглш-меха-низма, при котором синтезируется только фаговая цепь, и в головку фагов включаются одноцепочечные кольцевые молекулы фаговой ДНК. Эта последовательность необходимых для размножения фага событий была расшифрована посредством генетического анализа.

В таблице 7.2 перечислены 39 условно летальных мутаций фага фХ174; все они лишают фаг способности к размножению при инфицировании в непермиссивных условиях. Для того чтобы определить, влияют ли две независимо возникшие мутации на одну и ту же генетическую функцию или на разные, можно использовать комплементационный тест, описанный в предыдущей главе. Бактериальные клетки одновременно заражают фагами обоих мутантных типов при непермиссивных условиях, например при температуре 42°С, если оба мутанта чувствительны к температуре. Если в таких дважды инфицированных бактериальных клетках потомство фагов возникает, можно сделать вывод, что каждый фаг осуществляет функцию, которую не может осуществить другой (см. рис. 6.6). Такие две мутации называются комплементарными и относятся к разным генам. Выполняемый таким образом тест на комплементацию полностью аналогичен описанному в гл. 6 для мутантов эукариот. Возникает как бы «диплоидная» инфицированная клетка, в которой хромосома каждого фага несет по одной мутации, и наблюдается «диплоидный» фенотип, т. е. потомство фага либо возникает, либо нет. Заметим, что для выполнения теста на комплементацию нам не надо определять генотип фагового потомства.

Комплементационный анализ перечисленных в табл. 7.2 мутантов показывает, что они относятся к восьми различным группам комплементации. Так, например, при заражении непермиссивных бактерий фагами ami 0 (цистрон D) и ат9 (цистрон G) их клетки лизируются, и, следовательно, потомство фагов возникает. Напротив, при заражении непермиссивного хозяина фага ат.9 и ат32 потомство не возникает, и, следовательно, эти две мутации относятся к одной и той же группе комплементации (цистрон G). Если считать, что частота возникновения мутаций во всех генах примерно одинакова, то из факта, что в большинстве групп комплементации локализовано по нескольку мутаций, по-видимому, следует, что все эти мутации в совокупности затрагивают все важные гены фХ174. Другими словами, исследовано достаточное количество независимых мутаций для построения генетической карты. Далее мы увидим, что такое разделение на группы комплементации правильно отражает (за единственным исключением) механизм биохимического функционирования фага.

Рис. 7.3. А. Электронная микрофотография фаговых частиц фХ174 ( х 190 000). Внизу справа - фрагменты фотографии, на которых видна организация субъединиц капсида. (Jeffrey Tromans, Dr. Robert W. Home, the John Innes Institute, Norwich, England.). Б. Электронная микрофотография ДНК фага фХ174 в одноцепочеч-ной и репликативной двухцепочечной форме ( х 21 ООО). Двухцепо-чечные молекулы на фотографии имеют вид более толстых и менее извитых нитей по сравнению с одноцепо-чечными. (Dr. Richard Junghans and Professor Norman Davidson,

California Institute of Technology.)

Таблица 7.2. Классификация мутантов фага фХ

Цистрон Мутанты

A am 8, am 18, am 30, am 33, am 35, am 86, ts 128

В am 14, am 16, och 5, ts 9, ts 116, och 1, och 8, och 11

С och 6

D am 10, am H81

E am 3, am 6, am 27

F am 87, am 88, am 89, am H57, op 6, op 9, tsh 6, ts 41D

G am 9, am 32, ts y, ts 79

H am N1, am 23, am 80, am 90, ts 4

По Benbow R.M. et. al. 1971. J. Virol., 7, 549.

Рекомбинационный анализ мутантов фага 0 Х174

Когда фаги с различными мутантными генотипами заражают клетку, в которой они могут размножаться, то в потомстве обнаруживаются фаги как с родительскими, так и с рекомбинантными генотипами. Скрещивание между двумя различными ts-мутантами фага выполняют при пермиссивной температуре (30°С), а скрещивание между sus-мутантами фага-в клетках Su+-штамма. Суммарное число потомков всех генотипов определяют, высевая на чашки определенный объем культуры в пермиссивных условиях. Количество рекомбинантов дикого типа легко определить посевом такой же пробы в непермиссивных условиях, когда негативные колонии образуют лишь фаговые частицы дикого типа (см. рис. 6.2), точно так же, как это было с /-//-мутантами фага Т4.

Скрещивание фагов не вполне аналогично скрещиванию эукариотических организмов. Мы знаем, что при скрещивании двух эукариотических родителей 1) генетический вклад каждого родителя в потомство одинаков (это обеспечивается мейозом) и 2) если генетические маркеры не сцеплены, то в потомстве возникает равное число родительских и рекомбинантных генотипов. При скрещивании фагов, однако, относительный генетический вклад родителей в потомство, как было установлено, зависит от относительного числа родительских фагов каждого типа в данной инфицированной бактериальной клетке. Например, если отношение численностей родительских фагов с генотипами А а В равно А/В= 10/1, то часто обнаруживается, что число рекомбинантных потомков превосходит число потомков родительского типа В. При скрещивании фагов число родительских генотипов может быть больше двух. Если одна и та же клетка заражена фагами с тремя различными генотипами Л, Б и С, то в потомстве некоторые фаги будут обладать рекомбинантным генотипом ABC. Ясно, что динамика скрещивания фагов более сродни проблемам популяционной биологии, чем проблемам индивидуального скрещивания организмов, обладающих мейозом. Совокупность родительских геномов фагов, инфицирующих клетку, представляет собой популяцию-основателя. Эти геномы реплицируются и рекомбинируют с другими геномами, обладающими теми же или отличными генотипами. Рекомбинантные генотипы реплицируются наряду с родительскими, и при лизисе зараженной клетки освободившиеся фаговые частицы представляют собой выборку геномов из общего генофонда, содержащегося в клетке в момент упаковки ДНК в головки фагов.

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)