Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

, отсутствующем у партнера по скрещиванию, не должно приводить к появлению рекомбинантов дикого типа. Ни один из геномов, участвующих в таком

Г168

Щ

Г 1695

Г924

Рис. 6.5. Схема, иллюстрирующая механизм сокращения генетического расстояния между фланкирующими маркерами при скрещивании фаговых мутантов, несущих делению в одном и том же участке. \Nomura М., Benzer S. (1961). J. Mol. Biol, 3, 684.]

R 1695 R924

K_J___J

скрещивании, не содержит нужной нуклеотидной пары в месте точечной мутации. Следовательно, восстановление нуклеотидной последовательности дикого типа невозможно.

Функциональные особенности г#мутаций

Генетический анализ состоит в экспериментальном изучении отношений, существующих между мутантами. Для определения характера этих отношений используются два основных приема-рекомбинационный тест и тест на комплементацию. Рекомбинационный тест, как мы уже отмечали в предыдущем разделе, определяет взаимное пространственное расположение мутаций на генетической карте. Комплемента-ционный тест, с другой стороны, определяет функциональные отношения мутантов. Все г//-мутанты обладают одинаковым фенотипом (табл. 6.1). Одинаковы ли их генетические функции? Для ответа на этот вопрос клетки Е. coli К(Х) заражали различными парными комбинациями мутантов rll, как это схематически изображено на рис. 6.6. Если в такой дважды инфицированной клетке возникает потомство фага, то это означает, что каждый из двух мутантных фагов осуществляет функцию, которую не в состоянии осуществлять второй мутант. Такие два мутанта называют комплементарными. С другой стороны, если в такой дважды инфицированной клетке потомства фагов не возникает, то это означает, что оба мутанта не способны осуществлять одну и ту же функцию.

Комплементационный анализ г/7-мутантов легко проводится с помощью так называемого spot-теста. Клетки, инфицированные г 11-му-тантом с множественностью 0,1 (примерно один фаг на десять бактериальных клеток) смешиваются с теплым расплавленным агаром, и смесь наносится на поверхность питательной среды в чашке Петри. Когда агар затвердевает, на его поверхность капают несколько капель среды, содержащей другой г//-мутант. В месте падения капель некоторые клетки инфицируются обоими мутантами. Если при этом происходит комплементация, то в инфицированных клетках возникает потомство фагов обоих родительских генотипов (а также рекомбинантных генотипов). Это потомство инфицирует затем все остальные бактериальные клетки в покрытом каплей участке и убивает их. Таким образом, комплементация проявляется в лизисе бактерий на месте капли (рис. 6.7).

Результаты комплементационного теста показывают, что все rll-му-тации, за исключением некоторых делеций, распадаются на две группы, обозначаемые как А и В. Следовательно, r/7-фенотип может быть обусловлен утратой одной из двух генетических функций, А или В. Например, принадлежащий группе А мутант 104 не дает потомства при одновременном заражении с мутантами 47, 101 и 106 (рис. 6.4) и дает потомство при совместной инфекции с фаговыми мутантами из группы В, например 51 и 102. Делеций, которые не могут быть отнесены ни к одной из этих групп, включают в себя на генетической карте границу между этими двумя группами комплементации и потому утрачивают обе функции.

Цистрон

Использованный Бензером тест на комплементацию оценивает функциональные отношения между мутациями, находящимися в транс-конфигурации (рис. 6.8). Если две мутации принадлежат к одной группе комплементации и находятся в транс-положении, то они не комплемен-тируют и потомства не возникает. С другой стороны, если эти же две мутации находятся в i/uc-положении, то потомство образуется. Например, если бактериальную клетку штамма К (А,) одновременно заражают двойным г./7-мутантом и фагом Т4 дикого типа, то образуется потомство обоих генотипов. Фаг дикого типа осуществляет функции, необходимые для успешной репликации как генома дикого типа, так и мутант-ного генома. Если же две мутации относятся к разным группам комплементации, то и в цис-, и в транс-положениях они проявляют одинаковый фенотип: потомство возникает в обоих случаях.

Фенотипическое различие между цис- и транс-конфигурациями двух мутаций служит основой для генетического теста на общность функции, аналогичного цис-транс-тесту, впервые использованному Эдвардом Ле-висом при исследовании функциональных взаимоотношений псевдоаллелей различных генов дрозофилы. Например, мутации Star(S) и asteroid (ast) определяют форму и строение глаз дрозофилы. Первоначально считалось, что эти мутации аллельны, поскольку в мейозе они

Мутации в одной и той же Мутации в разных группах

группе комплементации комплементации

trans

|Х II Штамм 1 I X I I Штамм 1

| XII Штамм 2 | 1X1 Штамм 3

Результат: мутантный фенотип Результат: дикий фенотип

IX XI I Штамм 1 - 2 I X 1X1 Штамм I - 3

CIS

| | | Дикий тип | | I Дикий тип

Результат: дикий фенотип Результат: дикий фенотип

Рис. 6.8. Цис-транс-теа как пример комплементационного теста г/7-мутантов. Если фенотипическое проявление пары исследуемых мутаций различно в цис-и транс-положениях, то эти мутации затрагивают одну и ту же генетическую функцию. Если же фенотипы тождественны, то затрагиваются разные генетические функции.

Рис. 6.9. Применение цис-транс-теста к двум мутациям дрозофилы, затрагивающим строение глаза: Star(S) и asteroid(ast). Гетерозигота S/ + обладает доминантным мутантным фенотипом, так как один ген дикого типа в диплоидном наборе не обеспечивает нормальную функцию. Слева изображена муха с генотипом Sast/+ +, справа - S + fast + . Поскольку фенотипы, соответствующие двум указанным генотипам различны, можно сделать вывод, что эти мутации по-разному воздействуют на одну и ту же функцию. [Lewis Е. В. (1951). Cold. Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 16, 159.]

всегда расщеплялись. Мутация ast обозначалась как star-рецессивная (s), чтобы указать на ее аллелизм по отношению к Stor-доминант-ной мутации (S). Однако тщательное исследование потомства от самок с генотипом alSho/ + st, подвергнутых возвратному скрещиванию с самцами alsho/alsho, показало, что изредка при этом могут возникать потомки дикого типа s +. Частота возникновения таких особей составляет около 1:10 ООО, и во всех случаях они оказались рекомбинантными по фланкирующим (расположенным по обе стороны от этих мутаций) маркерам а\(aristaless) и ho. Генотип таких особей + + ho/alsho. Существование такого рекомбинантного потомства свидетельствовало о том, что мутации S и s расположены в разных точках хромосомы, причем S слева от s. Чтобы отразить этот факт, пришлось star-рецессивную мутацию переименовать в asteroid. Однако, поскольку обе мутации оказывают сходное влияние на фенотип, вопрос об их функциональных отношениях оставался открытым. Для ответа на него были сконструированы генотипы, содержащие эти мутации в yuc-(Sast/+ +) и трансположении (S + ast). Оказалось что цис- и транс-конфигурации этих мутаций имеют разное фенотипическое проявление (рис. 6.9), следовательно, обе мутации влияют на одну и ту же генетическую функцию. Для обозначения таких функциональных отношений между очень тесно сцепленными мутациями был введен термин псевдоаллелизм.

Учитывая важность цис-транс-теста для определения функциональной генетической единицы, Бензер предложил для обозначения групп комплементации r/7-мутаций термин «цистрон». С тех пор употребление термина «цистрон» в качестве синонима гена (как единицы функции) стало общепринятым.

Картирование йУмутаций с помощью делеций

Известно, что при скрещивании мутантов со штаммами, несущими делеций в соответствующей этой мутации области генетической карты, нельзя получить рекомбинантов дикого типа. Этот факт дает в руки исследователей мощный метод анализа, которым Бензер воспользовался для картирования тысяч независимых r/7-мутаций. Обдуманно упорядоченный набор делеций, представленный на рис. 6.10, делит rll-область на 47 отрезков, определяемых соседними концами различных пар делеций. Для того чтобы новую мутацию отнести к одному из этих 47 отрезков, достаточно произвести чуть больше десятка скрещиваний, при которых фиксируется лишь наличие или отсутствие рекомбинантов дикого типа при посеве на Е. coli К (А.). Эта методика схематически изображена на рис. 6.11. После того как установлена локализация некоторого числа независимых г//-мутаций в определенном отрезке, остается установить лишь их взаимное расположение друг относительно друга, и нет необходимости определять их положение относительно мутаций, локализованных в других участках карты.

Построенная таким способом (рис. 6.12) карта тонкой структуры спонтанных г//-мутаций показывает, что эти мутации более или менее случайно разбросаны по генетической карте. Исключение составляют две «точки», представляющие собой высокомутабильные участки ДНК.

13f|4 Е1И66

386 = !

:168 - ' 1993 - .

Н$8 я* 1231 ^ '184

' ' , 1 ' ? 250 "

? сзз

221 -; 1368 1 . РВ28

1605 - *ч - -*

Рис. 6,10. Делеции, концы которых делят область rll на 47 сегментов. Семь больших делений, изображенных в верхней части рисунка, позволяют разбить область на семь частей. Остальные делеции делят каждую из

этих частей на более мелкие участки. Концы, обозначенные вырезом, не использовались при определении границ участков. Указаны границы цистронов Л и В. [Benzer S. (1961). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 47, 403.]

Эта карта демонстрирует важный факт, что /-//-мутации, приводящие к утрате функции, т.е. к одному и тому же фенотипу, могут происходить во многих различных точках цистрона. Ясно, что число возможных аллелей rll очень велико. На реальность более глубокой дифференциации тонкой генетической структуры указывает тот факт, что спонтанные точечные мутации, расположенные в разных частях карты, ревертируют к дикому типу с различными и характерными для каждой мутации частотами. Следовательно, природа этих различных спонтанных мутаций, обусловливающих один и тот же фенотип, не может быть одинаковой. Сравнение карты

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)