рованной дочерней цепи, как это предсказывает модель Уотсона-Крика.

Аналогичные эксперименты проделывали с реплицирующейся ДНК множества различных прокариотических и эукариотических организмов, и каждый раз оказывалось, что ДНК реплицируется полуконсервативно. Эксперименты Мезелсона-Сталя были первым доказательством справедливости модели Уотсона-Крика. В настоящее время можно с уверенностью сказать, что основные положения этой модели убедительно подтверждены и структура двойной спирали легла в основу современной генетики.

Различные формы организации двухцепочечной ДНК

Пионерская работа Уилкинса и Франклин показала, что молекулы ДНК могут давать различную дифракционную картину в рентгеновских лучах в зависимости от содержания воды и солей. Модель, предложенная Уотсоном и Криком, соответствовала значениям параметров структуры, полученным на основе рентгенограммы так называемой В-формы ДНК, изображенной на рис. 4.9. Модель В-формы ДНК, представленная на рис. 4.12, характеризуется плоскопараллельным расположением пар нуклеотидных оснований внутри двойной спирали. Плоскости оснований почти перпендикулярны оси спирали и отстоят друг от друга на 3,4 А. Этой повторяющейся единице соответствуют яркие меридиональные дуги в верхней и нижней частях рентгенограммы, изображенной на рис. 4.9. Диаметр спирали почти в точности равен 20 А, а соседние пары нуклеотидных оснований повернуты друг относительно друга на 36°. В результате на один виток спирали приходится десять пар оснований. На рисунке изображена спираль с правым направлением вращения. Рентгенограмма ДНК, однако, не дает информации, достаточной для того, чтобы судить, является спираль правой или левой. При построении своей модели Уотсон и Крик выбрали направление вращения произвольно.

Все возможное разнообразие структур двухцепочечных молекул ДНК стало ясным относительно недавно в результате экспериментов по кристаллизации гомогенных двухцепочечных олигомеров ДНК, получаемых посредством химического синтеза. Дифракционные рентгеновские картины, полученные на таких кристаллах ДНК, более четки, чем получаемые на природной ДНК, и позволяют определить с большой точностью положения отдельных атомов. Эти исследования обнаружили, что как право-, так и левозакрученная двухцепочечная спираль ДНК может существовать в нескольких модификациях, характеризуемых различными значениями параметров (табл. 4.2). Тип спирали определяется свойствами растворителя и последовательностью нуклеотидов.

Самокомплементарный тетрамер ДНК типа CGCG (5'-конец всегда пишется слева) образует при кристаллизации левозакрученную двухце-почечную структуру, получившую название Z-ДНК из-за зигзагообразного характера фосфодиэфирного каркаса. Напротив, самокомплемен4.

8-121

тарный додекамер CGCGAATTCGCG кристаллизуется в форме право-закрученной двухцепочечной спирали В-формы, хотя этот додекамер содержит на обоих своих концах последовательность CGCG, которая сама по себе кристаллизуется в Z-форме. Эти две формы ДНК изображены для сравнения рядом на рис. 4.16.

Исследования структуры полимера (CG)„ в растворе показали, что эта молекула может существовать в одной из двух альтернативных форм, а именно в правой В-форме или левой Z-форме. Эти две формы переходят друг в друга при изменении ионной силы раствора или катионов, нейтрализующих отрицательный заряд на фосфодиэфирном каркасе. Природные молекулы ДНК в основном существуют в правой В-форме, если они не содержат последовательностей типа (GC)n. Однако если такие последовательности входят в состав ДНК, то эти участки при соответствующих условиях могут переходить в Z-форму. Возможность такого перехода указывает на то, что две цепи в двойной спирали ДНК находятся 'в динамическом состоянии и могут раскручиваться друг относительно друга, переходя из правой формы в левую и наоборот. Ясно, что молекулы ДНК для этого должны быть довольно лабильны и допускать конформационные превращения. Биологические следствия такой лабильности структуры ДНК пока не вполне понятны. Специфичные к Z-ДНК антитела реагируют с определенными участками гигантских хромосом клеток слюнных желез дрозофилы, что свидетельствует о том, что ДНК в хромосомах существует в обеих формах (рис. 4.17).

Организация ДНК в хромосомах

Молекулы ДНК в эукариотических хромосомах очень велики. Длина молекул ДНК, выделенных из клеток дрозофилы, достигает 1,2 см, и принято считать, что каждая эукариотическая хромосома содержит одну-единетвенную непрерывную молекулу ДНК. Упаковка таких огромных молекул в ядрах клеток является основной функцией гисто-нов, белков, характерных именно для эукариотических клеток.

Основная структурная единица эукариотической клетки-это нуклео-сома (рис. 4.18). Нуклеосома содержит по две молекулы каждого из четырех гистонов, Н2А, Н2В, НЗ и Н4, соединенных в форме октамера. Каждый октамер связан с последовательностью из примерно 200 ну-клеотидных пар длиной около 700 А. Точное взаимное расположение

Рис. 4.19. Схематическое изображение

участка соленоида; цепочка нуклеосом

(сферы), каждая из которой обмотана ДНК, образует винтовую линию.

гистона и ДНК в нуклеосоме неизвестно, но считается, что ДНК каким-то образом наматывается на октамеры гистона. Нуклеосома имеет диаметр около 100 А, и таким образом ДНК в нуклеосоме должна быть сложена примерно всемеро. Другой гистон, HI, обеспечивает связь между нуклеосомами, последовательность которых образует подобие винта (рис. 4.19). Диаметр этого винта ^называемого соленоидом) составляет по одним оценкам около 300 А, по другим-около 500 А. Это различие, вероятно, обусловлено тем, что для приготовления электронно-микроскопических препаратов использовали разные методы. Если принять диаметр соленоида равным 300 А, то упаковка последовательности нуклеосом в форме соленоида дает дополнительное уменьшение линейных размеров структуры в целом еще в 6 раз. В интерфазных хромосомах сам соленоид закручен винтом, образуя при этом полую трубку диаметром около 2000А, что дает очередное сокращение линейных размеров содержащей ДНК структуры еще примерно в 18 раз (рис. 4.20).

Переход от интерфазной хромосомы к метафазной хроматиде, вероятно, связан с еще одним аналогичным закручиванием теперь уже трубки диаметром в 2000 А в винтовую структуру диаметром около 6000 А (рис. 4.20). Эта общая схема организации ДНК в ядрах клеток игнорирует различия в степени спирализации, которые почти наверняка существуют между теми участками хромосом, которые участвуют в синтезе РНК и репликации ДНК, и теми, которые в этих процессах не участвуют. Кроме того, гетерохроматиновые участки хромосом более компактны, чем эухроматиновые. В любом случае ДНК в ядрах эукариотических клеток образует иерархическую систему спиралей, основной единицей которой является нуклеосома.

Хромосомы прокариотических клеток представляют собой кольцевые молекулы ДНК; у Е. coli длина кольца составляет 107 А, т.е. около 1 мм- Эта огромной длины кольцевая нить помещается в клетке

Вид сверху

Вид сбоку

Л ° \ °

длиной лишь 2-10 А при диаметре около 8• 10 А. Следовательно, ДНК может существовать в клетке лишь в высокоупорядоченном (конденсированном) состоянии. Хотя в прокариотических клетках нет белков гистонов, в них тем не менее содержатся некоторые белки, образующие комплексы с ДНК. При электронной микроскопии разрушенных определенным образом клеток Е. coli можно видеть, что ДНК собрана в «бусины», по величине очень близкие нуклеосомам эукариот (рис. 4.21). Эти бусины очень лабильны, что указывает на то, что взаимодействие между ДНК и белками в клетках Е. coli много слабее, чем между ДНК и гистонами эукариот. Характер иерархической конденсации хромосомы Е. coli не вполне понятен, но хромосома в целом может быть выделена в виде компактной структуры, называемой нуклеоидом.

Не вся ДНК эукариотических клеток находится в ядрах клеток. Митохондрии и недифференцированные хлоропласты растений, так называемые пластиды, представляют собой самореплицирующиеся орга-неллы и содержат собственные кольцевые молекулы ДНК. Эти молекулы очень невелики и кодируют ограниченное количество информации, необходимой для осуществления органеллами их функций. Так же как и хромосомы прокариот, они не связаны с гистонами и образуют внутри органелл нуклеоиды.

Общие особенности репликации ДНК

Нативные молекулы ДНК очень велики и при экстракции из клеток обычно разрываются в результате физических или ферментативных воздействий. Мезелсон и Сталь в своих экспериментах по репликации ДНК Е. coli имели дело со сравнительно небольшими фрагментами ДНК, и полученные ими результаты относятся только к состоянию ДНК, предшествовавшему репликации и после нее. Полная репликация хромосомы Е. coli впервые наблюдалась Джоном Кейрнсом. Он разработал метод очень мягкого разрушения клеток Е. coli. В результате Кейрнсу удалось выделить интактные хромосомы Е. coli и пометить их радиоактивным 3Н-тимидином. Меченые хромосомы аккуратно переносили из раствора на твердую поверхность, которая затем покрывалась в темноте фотографической эмульсией и в течение нескольких недель экспонировалась. В это время электроны, испускаемые радиоактивной ДНК, вызывали образование зерен серебра в фотоэмульсии вдоль молекул ДНК. Последующая обработка эмульсии дает радиоавтограф хромосомы, на котором цепочка зерен серебра отслеживает конформацию молекулы ДНК. Применение метода радиоавтографии привело прежде всего к установлению того факта, что ДНК Е. coli имеет кольцевую форму (рис. 4.22). Впоследствии было показано, что такую же форму имеет ДНК всех прокариотических организмов, а также вирусов и органелл эукариотических организмов.

В настоящее время для молекул ДНК известны три основные кон-формации и соответственно три основных способа репликации. Кольцевые молекулы ДНК, например реплицирующаяся форма ДНК фага лямбда, могут реплицироваться способом, обнаруженным на радиоавтографах хромосом Е. coli. Репликация кольцевой молекулы ДНК начинается в определенной точке кольца и приводит к образованию «вздутия», расширяющегося в двух направлениях