4 5 6 7

Время встряхивания на мешалке, мин

Рис. 4.6. Л. Схема опыта Херши-Чейза, показавшего, что компонентом, ответственным за образование потомства фага Т2 в зараженной фагом клетке, является ДНК фага. Б. Судьбу ДНК фага Т2 можно проследить, измеряя радиоактивность. Изотоп фосфора 32Р, который служит

меткой ДНК, остается связанным с зараженной клеткой, тогда как белок фага, меченный радиоактивной серой 35S, может быть удален с поверхности инфицированной клетки; при этом инфекционный процесс не прервется.

щую примерно из 6400 нуклеотидов, заключенную в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из примерно 2130 одинаковых субъединиц, каждая из которых представляет собой полипептидную цепь из 158 аминокислот, расположенных в определенной последовательности.

Существуют химические методы, позволяющие разделить РНК и белок вируса (рис. 4.7). Обычно очищенный препарат РНК ВТМ сохраняет не более 0,1% инфицирующей активности препарата интактного (неповрежденного) вируса. Однако при надлежащих условиях вирус можно в лабораторных условиях реконструировать из смеси очищенного белка. Субъединицы белка соединяются друг с другом и с РНК, образуя ин-тактный вирус с нормальной способностью к инфекции.

Известно множество разновидностей ВТМ, отличающихся по кругу растений-хозяев и по вирулентности на различных растениях. Между ними существуют заметные различия и в аминокислотном составе белков. Например, в белковой оболочке ВТМ стандартного штамма отсутствуют гистидин и метионин, тогда как в вирусах штамма HR эти аминокислоты содержатся. Были проделаны эксперименты по реконструкции гибридных вирусов из очищенного белка HR и очищенной РНК стандартного штамма. Такие вирусы обладали нормальной инфекцион-ностью. Когда же этими вирусами заражали растения, то состав белковой оболочки потомства гибридных вирусов совпадал с составом белков штамма, из которого была взята РНК. Состав белковой оболочки гибридного вируса не наследовался; потомство таких вирусов имело белковые оболочки, состав которых определялся исключительно РНК. Оказалось, что лишь РНК обладает функциями, необходимыми для наследственной передачи этого признака (рис. 4.7).

Неопровержимым доказательством того, что носителем наследственных свойств вирусов служат именно нуклеиновые кислоты, можно считать демонстрацию инфекционных свойств очищенной нуклеиновой кислоты. Как уже указывалось, очищенная РНК ВТМ обладает слабой инфекционностью. Этот факт сначала объясняли тем, что в составе очищенного препарата РНК могло сохраниться некоторое количество ин-тактных вирусов. Однако дальнейшие исследования показали, что ин-фекционность препаратов РНК ВТМ разрушается в результате обработки очищенным ферментом поджелудочной железы млекопитающих, называемым рибонуклеазой. Этот фермент гидролизует незащищенную РНК, но не влияет на инфекционность интактных частиц ВТМ. Пониженная способность к инфекции препаратов РНК ВТМ по сравнению с интактными вирусами объясняется отсутствием белковой оболочки, защищающей РНК от гидролиза. Рибонуклеазы растения разрушают большую часть РНК до того, как они проникают в клетку. Однако тщательные исследования показали, что одна-единственная молекула РНК интактного вируса способна заразить растительную клетку и привести к образованию полноценных частиц ВТМ.

Впоследствии было показано, что очищенная ДНК некоторых фагов, из которых наиболее известны фХ174 и X, может заражать бактерии и в отсутствие белковой оболочки. Свободным молекулам ДНК нелегко проникнуть через клеточную стенку. Однако, обрабатывая бактерии Е. coli определенным ферментом, а именно лизоцимом яичного белка, можно сделать их клеточную стенку проницаемой. Бактериальные клетки, стенки которых обработаны таким способом, называются сферопла-стами (из-за сферической формы, которую приобретают бактерии в результате такой обработки). Сферопласты не способны к нормальному росту, однако они могут быть инфицированы молекулами ДНК, выделенной из фагов фХ174 и А,, и производить полноценные фаговые частицы. Такие эксперименты показывают, что именно ДНК, а не белок является наследственным материалом бактериофагов.

Таким образом, уже в результате первых исследований стало ясно, что именно нуклеиновые кислоты являются носителем наследственности во всех организмах. Два типа нуклеиновых кислот-ДНК и РНК-выполняют генетические функции во всех прокариотических и эукариотических клетках. Однако вирусы содержат лишь тот или иной тип нуклеиновых кислот.

Химический состав и строение нуклеиновых кислот

Основная структурная единица нуклеиновых кислот -нуклеотид. Ну-клеотид состоит из трех химически различных частей, соединенных ко-валентными связями (рис. 4.8). Первая часть-это содержащий пять атомов углерода сахар: дезоксирибоза в ДНК и рибоза в РНК. Вторая

часть - пуриновое или пиримидиновое азотистое основание, ковалентно соединенное с первым атомом углерода сахара, оно формирует структуру, называемую нуклеозидом. ДНК содержит пуриновые основания -аденин (А) и гуанин (G)-h пиримидиновые основания-цитозин (С) и химии (Т); соответствующие нуклеозиды называются дезоксиаденозин, де-зоксигуанозин, дезоксицитидин и дезокситимидин. РНК содержит те же пуриновые основания, что и ДНК, а также пиримидин цитозин, но вместо тимина в ее состав входит урацил (U); соответствующие нуклеозиды называются аденозин, гуанозин, цитидин и уридин. Третью часть нуклеотида составляет фосфатная группа; фосфатные группы соединяют соседние нуклеозиды в полимерную цепочку посредством фосфо-диэфирных связей между 5'-атомом углерода одного сахара и З'-атомом углерода другого (рис. 4.8, Б и В). Нуклеотидами называются нуклеозиды с одной или несколькими фосфатными группами, присоединенными эфирными связями к 3'- или 5'-атомам углерода сахара. Синтез ну-клеотидов предшествует синтезу нуклеиновых кислот, и соответственно нуклеотиды являются продуктами химического или ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот.

Нуклеиновые кислоты-это очень длинные полимерные цепочки, состоящие из мононуклеотидов, соединенных 5'-3'-фосфодиэфирными связями. Интактная молекула РНК содержит от 100 до 100000 и более ну-клеотидов. Интактная молекула ДНК содержит в зависимости от вида организмов от нескольких тысяч до многих миллионов нуклеотидов. В те времена, когда Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти ставили свои эксперименты на ДНК пневмококков, считалось, что структура молекул ДНК относительно проста и представляет собой определенную тетра-нуклеотидную последовательность, например pApCpGpTOH, многократно повторенную, так что она образует полимер вида (pApCpGpT)„. Таким образом, казалось, что ДНК не обладает сложностью, необходимой для того, чтобы служить веществом наследственности.

Последующие химические исследования Эдвина Чаргаффа по составу ДНК многих различных организмов убедили научную общественность в том, что ДНК в действительности обладает сложностью, необходимой для передачи наследственной информации. Исследования Чаргаффа показали, что состав оснований в ДНК различен у различных видов организмов. Это наблюдение исключило возможность того, что все молекулы ДНК состоят из одинаковых тетрануклеотидов. Исследования Чаргаффа выявили также одну замечательную особенность, присущую всем молекулам ДНК: молярное содержание аденина равно содержанию тимина, а молярное содержание гуанина - содержанию цитозина. Эти равенства называются правилами Чаргаффа: [А] = [Т], [G] = [С]; количество пуринов равно количеству пиримидинов. В зависимости от видовой принадлежности меняется лишь отношение ([А] + + [T])/([G] + [С]) (табл. 4.1).

Наблюдения Чаргаффа показали, что молекула ДНК может быть устроена много сложнее, чем предполагали до того, поскольку в соответствии с полученными им данными молекулы ДНК могли представлять собой самые различные последовательности оснований. Вскоре после работ Чаргаффа Уотсон и Крик фактически показали, что правила Чаргаффа не накладывают никаких ограничений на возможное число различных последовательностей оснований, которые могут образовывать молекулы ДНК.

Сахар — дезоксирибоза Сахар - дезоксирибоза

— —Нуклеотид ' ^ Нуклеотид —

I I

Дезоксиаденозин -5 'фосфат Дезокситимидин 5 фосфат

Дезоксигуанозин Дезоксицитидин

Нуклеозид J [ -~ Нуклеозид |

Пуриновое основание - гуанин Пиримидиновое основание - цитозин

Сакар - дезоксирибоза Сахар -- дезоксирибоза

Нуклеотид 1 I Нуклеотид

Дезоксигуанозин-5'-фосфат Дезоксицитидин 5 фосфат

Модель структуры ДНК Уотсона-Крика

В 1953 году Джеймс Уотсон и Френсис Крик предложили модель структуры ДНК, которая с тех пор многократно проверялась и признана правильной в целом и во многих деталях. Их модель основывалась на четырех группах данных (рис. 4.9):

1. ДНК представляет собой полимер, состоящий из нуклеотидов, соединенных 3'-5'-фосфодиэфирными связями.

2. Состав нуклеотидов в ДНК подчиняется правилам Чаргаффа.

3. Рентгенограммы волокон ДНК, впервые полученные Морисом Уилкинсом и Розалиндой Франклин, указывают на то, что молекулы обладают спиральной структурой и содержат более одной полинуклео-тидной цепи.

4. Кислотно-щелочное титрование нативной ДНК показывает, что ее структура стабилизируется водородными связями. Титрование и нагревание нативной ДНК вызывают заметные изменения ее физических

Рис. 4.9. Наблюдения, использованные Уотсо-ном и Криком при построении модели структуры ДНК. А. Нуклеотиды связаны 3'-5'-фосфодиэфирными связями. Б. Правила Чаргаффа. В. Нагревание приводит к изменению физических свойств нативной ДНК, но не разрывает ковалентные связи (Prof. Maurice H.F. Wilkins, Kings College, London).

5' -конец

О = P — О— CH, Основ ание

О

О

СГ

Молекулы А — с молекулами Т Молекулы G — с молекулами С

Нагревание

Г Вязкий раствор ДНК —»- невязкий раствор ДНК

или щелочь

Рис. 4.10. Пара оснований, связанных в ДНК водородной связью. Аденин образует пару с тимином посредством двух водородных связей, а гуанин связан с цитози-ном тремя водородными связями. Обратите внимание на то, что водородными связя